乙基文胺生产真菌CH1(Geomyces sp)原生质体的制备与再生外文翻译资料

 2022-08-08 14:57:29

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长春西汀是一种半合成化合物,来源于生物碱长春胺,具有治疗和预防脑血管循环和血管认知障碍的有效药理活性。长春西汀可以通过一步化学反应从乙基文胺开始,两步化学反应从文胺开始。在我们先前的研究中,内生真菌CH1。被分离并鉴定为乙基长春胺的生产者,这是第一次通过内生真菌发酵获得的。然而,生产基本上是有限的。真菌原生质体是原生质体融合、基因转移和代谢物产生等生理和遗传研究的有价值的实验工具。本文对CH1株原生质体的制备和再生的关键因素进行了优化。利用渗透稳定剂(0.7mol/L NaCl)中纤维素酶(2.0%,w/v)、胶质酶(3.0%,w/v)和苦参碱酶(1.0%,w/v)组成的酶混合物,在pH 5.0-6.0的72h后,在30℃下消化1.5h,用菌丝体获得最高的原生质体产量(6.78times;107/mL)。 对制备的原生质体进行纯化后,用双层平板培养法在再生培养基中再生。

关键词:制备,再生,原生质体,内生真菌,乙烯胺。

长春西汀是一种半合成化合物,可以通过一步化学反应从乙基文胺开始,两步化学反应从文胺开始(图1)。长春西汀在许多国家被用于治疗和预防脑血管循环和血管认知障碍[1-3]。 在我们先前的研究中,内生真菌CH1。被分离并鉴定为乙基长春胺的生产者,这是第一次通过内生真菌发酵获得的。CH1为长春西汀[4]半合成生产最重要的中间乙基长春胺提供了一种新的可靠途径。然而,CH1乙基长春胺产率低,不能满足商业要求。因此,了解其生物合成途径和机制,并通过开发有效的方法提高菌株CH1的生产力具有重要意义。

图1:长春胺中长春西汀的生物合成。

原生质体是用机械或酶法[5]去除细胞壁后活细胞的所有成分。目前,真菌原生质体已成为原生质体融合、基因转移和代谢物产生等生理和遗传研究的有价值的实验工具。为了改进菌丝细胞原生质体的制备和再生方法,进行了大量的真菌遗传研究。对于每一株菌株,必须考虑裂解酶系统,消化条件和渗透稳定剂的影响,以便在不影响其生存能力[5-6]的情况下建立原生质体分离和再生的最佳条件。虽然许多研究人员已经为原生质体的分离和再生建立了不同的实验条件,但没有一种方法是所有真菌菌株共有的,优化每个真菌的条件是非常重要的[7-9]。在本研究中,我们研究了一些关键因素,以制备和再生原生质体从乙基文胺产生真菌内生真菌CH1,并最终获得了最合适的实验条件。 这些结果可能是原生质体融合构建生产乙基长春胺菌的工程菌株和获得该化合物高产的基础。

消化前CH1菌丝体的链状如图2a所示。消化30min后菌丝开始变化,原生质体开始形成(图2b)。 随着消化时间的延长,菌丝开始断裂,许多原生质体被释放(图2c)。 在原生质体形成过程中,原生质体从分裂的菌丝体中释放出来。在消化结束时,原生质体呈球形,几乎没有观察到菌丝体(图2d)。

为了提高原生质体的产量,我们首先研究了裂解酶系统与原生质体产量的关系,以选择最优的裂解酶系统。通过正交实验确定了不同浓度和不同组合的纤维素酶、胶质酶和崩溃酶对CH1原生质体制备的影响(表1)

最佳条件是纤维素酶(2.0%,w/v)、胶质酶(3.0%,w/v)和苦参酶(1.0%,w/v)的结合。 其作用按递减顺序依次为:纤维素酶、德氏酶和胶质酶。结果表明,这三种酶的结合获得了比单独使用的任何一种酶的更高的原生质体产量;这些结果与其他作者[6,10]的结果一致。 这可能是由于真菌具有复杂的结构,三种酶具有不同的功能,它们的结合可能具有协同作用。

图2:菌株CH1原生质体的形成和释放。

a:原微结构;

b:酶解30分钟后的微观结构;

c:酶解1小时后的微观结构;

d:消化结束时的微观结构。

表1:酶解因子对原生质体制备的正交实验

其中T1是三种不同酶第一含量水平下三种原生质体产量之和,T2是三种不同酶第二含量水平下三种原生质体产量之和,T3是三种不同酶第三含量水平下三种原生质体产量之和,X1是三种不同酶第一含量水平(X1=T1/3)下三种原生质体产量的平均值,X2是三种不同酶第二含量水平(X2=T2/3)下三种原生质体产量的平均值,X3是三种不同酶(X3=T3/3)第三含量水平下三种原生质体产量的平均值,R是X{max(X1,X2,X3)-min(X1,X2,X3)}三个值的最大差异,显示了三种不同酶的作用程度。

研究了预处理对原生质体制备的影响。已证明巯基乙醇能破坏菌丝外泌体蛋白的二硫键,破坏细胞壁的保护层,增强细胞壁对酶的敏感性[11]。在本工作中,菌丝体在28℃预处理溶液中浸泡30分钟后再进行酶解。 与未处理的菌丝体相比,预处理溶液中原生质体产量较低。即预处理没有提高原生质体产量[12]。然而,在预处理溶液和酶溶液的混合物中,原生质体产量下降。徐[13]和李[6]等人也发现了类似的现象。其原因可能是菌丝体预处理后细胞壁和细胞膜的酶解导致原生质体产量低于直接酶解。

我们用纤维素酶(2.0%,w/v)、胶质酶(3.0%,w/v)和苦参酶(1.0%,w/v)研究了菌丝体年龄与原生质体产生的关系。表2显示,在优化的裂解酶系统的基础上,制备原生质体的最佳菌丝年龄为72小时。根据结果,延长孵育时间时原生质体产量首先增加;菌丝年龄为72小时时,最大制备频率为5.02times;107/mL。当菌丝龄超过72h时,原生质体产量逐渐下降。 这可能是因为当菌丝年龄较短时,细胞壁不够紧密,容易释放原生质体。然而,产生的原生质体不是很稳定,很容易破碎。随着培养时间的延长,菌丝细胞壁将变得越来越紧密,难以去除,导致原生质体产量下降。

表2:菌丝年龄、消化温度和pH值对原生质体制备的影响

用纤维素酶(2.0%,w/v)、胶质酶(3.0%,w/v)、苦参酶(1.0%,w/v)和菌丝体年龄72h(表2)研究了pH对原生质体制备的影响。结果表明,6.0为最优p H值,最大原生质体产量为5.43times;107/mL。较高或较低的pH值降低了原生质体的产量,因为pH值由于对酶活性的影响而间接影响原生质体的产生。

在相同的条件下,在pH6.0(表2)下,研究了消化温度对原生质体制备的影响。 不同的消化温度分别为27℃、30℃、33℃、36C和39℃。 在优化酶组合的基础上,最优消化温度为30℃,当原生质体产量达到5.82times;107/mL时。在较高和较低的温度下,原生质体产量较低可能是温度对酶活性影响的结果。

在相同条件下,在pH6.0和30℃下,研究了消化时间对原生质体制备的影响。图3显示,随着消化时间的增加,原生质体产量增加,当消化时间为1.5小时时,最大为5.96times;107/mL。然而,当消化时间大于此时,原生质体产量逐渐下降。这可能是由于原生质体的过度消化,导致再生引物的丢失和原生质体活性的降低。

研究了渗透稳定剂对原生质体产量的影响,在相同的条件下,在pH6.0和30℃原生质体研究了渗透稳定剂对原生质体产量的影响。

图3:消化时间对原生质体制备和再生的影响

图4:渗透稳定剂对原生质体制备的影响

消化温度为30℃,消化时间为1.5h。图4显示,在最佳酶组合、菌丝年龄、温度、pH和消化时间的基础上,0.7mol/L NaCl是最合适的渗透稳定剂。原生质体产量达到6.78times;107个/mL。

渗透稳定剂在原生质体形成中起着重要作用,因为它可以提供渗透压,以防止原生质体在去除细胞壁后被破坏,并有助于提高酶活性。渗透稳定剂如无机盐、糖和糖醇已被用于真菌原生质体的制备和再生[5]。稳定剂的种类和浓度都会影响原生质体的制备和再生。在我们的实验中,不同的渗透稳定剂,NaCl,KCl,山梨醇和甘露醇,在不同的浓度下尝试。结果表明,NaCl在0.7mol/L时是CH1原生质体生产的最佳渗透稳定剂。赵[10]和周[14]等人已经报道,0.7mol/L NaCl是生产紫杉醇的真菌结节孢子菌制备和再生原生质体的最佳渗透稳定剂。 萨维萨等人[5]报道,0.6MKCl被观察到是最好的渗透稳定剂的腐竹和木霉。因此,无论是真菌中原生质体的产生还是再生,都没有常见的渗透稳定剂,确定每种真菌的最佳稳定剂是非常重要的。

原生质体再生频率往往是原生质体产生的重要因素。在本研究中,我们使用单层和双层平板培养方法研究原生质体的再生频率。调整原生质体制备后,将制备好的原生质体在含有0.7mol/LNaCl的再生培养基中进行再生,分别采用单层和双层平板培养方法;采用双层平板培养方法时原生质体再生频率较高。这表明双层平板培养法可以保护原生质体,而不影响其完整性。对照结果还表明,渗透稳定剂在原生质体再生中起着重要作用。

在调整不同消化时间制备的原生质体浓度后,用双层平板培养法在含有NaCl的培养基中再生原生质体。图3显示原生质体再生频率在短时间内变化不大。然而,随着消化时间的延长,原生质体的再生频率逐渐降低。这可能是由于长时间消化后合成细胞壁的引物丢失。因此,考虑到原生质体的制备频率和再生频率,选择1.5h作为最合适的消化时间。

为了研究CH1再生原生质体的稳定性,观察了200个再生原生质体的菌落形态、生长和分生孢子。再生菌株无明显变异,与原株相似。这表明CH1在本研究中使用的原生质体的制备和再生系统中具有良好的稳定性。

总之,真菌菌株中原生质体的产生或再生没有常用的方法,确定CH1的最佳条件是非常重要的。结果表明,CH1原生质体是一种很有前途的再生系统。通过本实验得到的原生质体为原生质体融合和真菌改良研究提供了一定的参考框架,以获得高产量的乙基文胺。

实验

材料:酶纤维素酶,胶质酶和崩溃酶购自中国上海雅森生物科技有限公司;其他试剂和化学品(分析等级除另有说明外)均购自天津达茂化学试剂有限公司(中国)。本研究以内生真菌GeomycesspCH1为亲本菌株。本课题组从湖南省衡山地区的科植物中分离得到。已存入中国类型文化收藏中心(CCTCCM2014676)[4]。

培养基:以马铃薯葡萄糖琼脂(PDA)为培养基,由20%马铃薯汁、2%葡萄糖和2%琼脂组成;PDA液体培养基为PDA培养基,不含琼脂。再生培养基为含0.7mol/LNaCl的PDA培养基。

内生真菌菌丝体的制备:菌株CH1在27℃的PDA斜面上孵育3天,然后接种到含有100mL PDA液体培养基的250mL烧瓶中,在27℃的旋转摇床上以170r pm培养3天。之后,用4000r pm离心收集培养的菌丝体5min,然后用渗透稳定剂洗涤两次。

酶液的制备:制备了三种不同浓度和不同组合的酶纤维素酶、胶质酶和崩溃酶,用于去除细胞壁(表1)。

渗透稳定剂的制备:以不同浓度(0.5、0.6、0.7和0.8mol/L)的NaCl、KCl、山梨醇和甘露醇为渗透稳定剂[8]。其中,0.7mol/LNaCl是最合适的,并被用于进一步的研究。

预处理:对采集的菌丝体进行直接和间接的预处理。 在直接预处理中,菌丝体在酶解前渗透到预处理溶液0.5%巯基乙醇在1.0mol/L磷酸盐缓冲液中,pH6.0。

原生质体的制备:将菌丝转移到5米L管中,底部水平,每根200毫克湿菌丝体。将渗透稳定剂中的混合酶以100mg湿菌丝体与1mL酶溶液的比例加入到含有湿菌丝体的试管中。湿菌丝体在30℃下以75转/分的转速在旋转摇床中消化。酶解后,加入1.5倍体积的渗透稳定剂,通过3层透镜纸过滤,从菌丝碎片中分离原生质体。 然后将原生质体悬浮液在3000r pm离心10min。 原生质体颗粒用渗透稳定剂收集和洗涤两次,然后再悬浮在渗透稳定剂中。 最后,通过倒置显微镜观察原生质体的形态,用血细胞计数板计数原生质体的产量,并使用以下公式计算[6]:

Pf=NP/V

其中Pf是原生质体产量(每mL的原生质体数量),NP是原生质体数量,V是酶液体积。

原生质体再生:原生质体悬浮液用渗透稳定剂稀释十倍,然后用单层或双层方法在再生介质中培养[14]。 剩余内容已隐藏,支付完成后下载完整资料


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