绿色木霉J1-030基因组挖掘:新倍半萜合酶及其产物的发现和鉴定外文翻译资料

 2022-08-08 14:58:39

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绿色木霉J1-030基因组挖掘:新倍半萜合酶及其产物的发现和鉴定

摘要：尽管丝状真菌可以有效地生产萜类化合物，但绿色木霉的倍半萜合成酶的研究却很少。利用法尼基二磷酸过表达酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)平台生产多种萜类化合物，通过基因组挖掘，从绿色T. viride中鉴定出一种未知的倍半萜合酶，并确定了相应产物的结构。通过GC-MS和1D、2D NMR对一个新的5/6双环倍半萜及其酯化衍生物进行了表征。据我们所知，这是迄今为止第一个从T. viride中确定的倍半萜合酶。

绪论

萜类化合物是一类最多样的天然产物，广泛分布于微生物、植物、昆虫和各种海洋无脊椎动物中[1,2]。目前已经鉴定出超过80000种萜类化合物[3-5]。这些多样而复杂的天然产物大多来自于由萜类合成酶(TPSs)[6]催化的C5型线性异戊二烯前体碳正离子环化反应。根据其氨基酸序列可分为三种类型。I型TPSs是一种依赖金属的酶，通过去除前体上的二磷酸基团和形成碳正离子来启动环化过程，而II型TPSs通过烯双键[7]的质子化来启动催化过程。最近报道的III型TPSs，即ubia相关的TPSs，也通过二磷酸消除[8]催化级联反应。此外，每一种TPS都具有独特的富含天冬氨酸的基序;大多数I型TPSs具有DDXXD/E基序和NSE/DTE基序，而II型TPSs具有DXDD基序[9,10]。

C15倍半萜类化合物是一类具有广泛工业和商业应用的萜类化合物，包括作为生物活性分子在香精和香水中的应用。在制药工业，和在保健产品[11]。以二甲基烯丙基二磷酸(DMAPP)和异戊烯基二磷酸(IPP)为底物，以通用线性前体法尼酰基焦磷酸(FPP)为原料，经FPP合成酶组装合成倍半萜类化合物。随后在倍半萜合酶的催化下，FPP中的二磷酸被消除，并通过进一步的环化步骤形成结构多样的(聚)环核心骨架[3,12]。一组修饰后的酶可以将核心倍半萜骨架转化为具有潜在的抗癌、细胞毒性和抗菌功能的多种倍半萜类化合物[13]。通过倍半萜合酶从倍半萜前体FPP中分离得到121个骨架结构。近75%的这些结构至少有一个六元环;其中69%包含五成员环，占很大一部分。三元环和七元环结构分别只占这些结构的21%和24%。[14]中很少发现四(10%)和八(7%)元环结构(如asteriscanide)。随着基因测序的成本降低,通过测序和注释进行基因挖掘的最近发展导致了大量的功能未知的萜烯合成酶[15-17]的发现,生成不同的复杂的结构和几种生物活性产物（例如6alpha;、9alpha;、15-三氢氧基南-4-烯-3-酮,( ) -3、11、12-三氢氧基烯,(minus;)3,10,11,12-四氢氧基烯)[18]。

丝状真菌是萜类产品[19]的强大生产者。这些真菌产生的许多萜类化合物最近已被鉴定出来;这些萜类化合物具有多种复杂的结构和不同寻常的催化机理。然而，在少数真菌类群(如trefolane a和sterhirsutin)[21]中发现了少量倍半萜类化合物。绿色木霉(Trichoderma viride)是一种丝状真菌，作为一种有效的生物防治剂，来对抗两种侵染大豆的病原菌——尖孢镰刀菌(Fusarium oxysporum f. sp. adzuki)和阿曲霉(Pythium arrhenomanes)，受到了广泛的关注。这种真菌是一种合格的真菌寄生菌，能产生次级代谢产物[22,23]。然而，目前对绿色木霉萜类化合物的研究较少，且自然条件下产物浓度较低，限制了该领域的研究步伐。代谢工程使绿色木霉的不同萜类物质过量生产成为可能[21,24]。为了提高萜类产品的发现效率，在大肠杆菌和酿酒酵母中异源表达各种来源的萜类合成酶是一种可行的方法[25,26]。

在这项研究中,采用基因组挖掘和代谢工程结合的方式，以法尼基二磷酸过表达酿酒酵母作为一个平台(图1)，进行倍半萜类的发现。通过从绿色木霉基因组中预测萜烯合成酶的异源表达，鉴定并表征了一种未知的倍半萜合酶。通过GC-MS和1D、2D NMR对该酶合成的新化合物及其酯化产物进行了检测和表征，发现该化合物为5/6双环倍半萜及其C-11酯化结构。根据文献检索，这是我们所知的首次报道的倍半萜合酶在绿色木霉中的特征。此外，本研究还验证了基因组挖掘和预测萜类合成酶的异源表达相结合、用于检测真菌中未知萜类化合物的有效性。

图1 酿酒酵母倍半萜生产平台及Tvi09626产品示意图

结果与讨论

绿色木霉 J1-030萜类合成酶基因的预测与分析

通过对绿色木霉 J1-030的基因组测序和J1-030基因组中潜在的萜类合成酶的预测，选择基因Tvi09626，对该未知萜类合成酶的功能进行以下生物信息学分析。用Tvi09626在NCBI数据库中进行蛋白blast搜索，与病毒T. Gv29-8[27]和T. reesei QM6a[28]的序列分别鉴定为89.66%和85.23%，且仅具有预测功能。随后，对几个已知的萜类合成酶进行氨基酸序列分析发现，Tvi09626具有典型的高度保守的128DDxxD/E富含天冬氨酸基序、276NSE/DTE三联体、366RY二聚体和230R单体(图S1，支持信息文件1)[29-31]。此外，在系统发育分析(图2)中，Tvi09626属于第I类萜类合成酶的第V支。在以往的研究中，对木霉属中的萜类合成酶进行了研究，如哈茨木霉[32]的trichodiene合成酶同源基因的分离和鉴定，以及对T.virens[33]中萜类合成酶vir4的功能鉴定。

然而，由于以往对绿色木霉烯类萜类合成酶的研究普遍缺乏，Tvi09626是第一个被鉴定出含有绿霉烯类产物的萜类合成酶。

Tvi09626功能的体外分析

为了验证候选酶的功能，我们从绿色木霉基因组中扩增了Tvi09626的DNA序列。将该基因片段克隆到pET28a( )载体上，构建质粒pXS222。然后将pXS222转化到BL21中，过表达纯化Tvi09626(图S2，支持信息文件1)。将底物GPP、FPP和GGPP分别与蛋白孵育，用气相色谱-质谱(GC-MS)对产物进行检测和分析[30,34]。体外实验清楚地表明Tvi09626可以使用FPP作为其唯一的底物来产生化合物1(图3和图S3，支持信息文件1)。

Tvi09626在酿酒酵母中的异源表达

为了进一步验证推测的萜类合成酶的功能，我们利用代谢工程策略在酿酒酵母中重建了一个FPP过剩生产平台，以获得足够数量的Tvi09626产品进行化学结构表征。酿酒酵母YZL141,改造之前[21],使用由于它能够提供足够的IPP, DMAPP,和FPP对萜类化合物的生产(图1)。72 h shaken-flask发酵后,压力提取与己烷/乙酸乙酯(4:1),pre-separated硅胶柱层析法,并用gc - ms检测。类似于体外试验结果,化合物1是最终产品(图4)。有趣的是,在提取过程中,化合物2被发现在保留时间为14.53分钟,确认为酯化剂1(图4和表S4,支持信息文件1)。利用代谢工程策略,Tvi09626的产品是通过丰富的高效浓缩FPP供应。

图2 Tvi09626与其他萜类合成酶的系统发育分析。6个分支用不同的颜色标记，Tvi09626在分支v中用红色标记。百分比表示基于1000个bootstrap重复的分支支持度。

图3 在体(I)、酵母YZL141 (II)、体外加FPP的Tvi09626 (III)和加FPP的煮沸Tvi09626 (IV)产物的GC-MS色谱图。

图4 Tvi09626产品特性。(A)化合物1 (m/z 222)在tR = 13.46 min时的质谱，化合物2 (m/z 264)在tR = 14.53 min时的质谱。(B)化合物1的COSY、HMBC和NOESY相关性。

Tvi09626产品的检测与表征

采用半制备高效液相色谱法纯化化合物1和化合物2(分别为23.1 mg和13.2 mg)。两个新化合物的结构通过1D和2D NMR光谱进行了表征(表1，表S4，图S4 - S15，支持信息文件1)。

表1 CDCl3中化合物1的1H NMR (400 MHz, CDCl3)和13C NMR (100 MHz)数据。

化合物1为已知骨架[35]的新化合物，分离为白色粉末。1H和13C NMR数据显示，在delta;H 1.87 (t, J = 1.2 Hz, 3H，)，delta;H 0.96 (s, 3H)，delta;H 0.83 (s, 3H)，delta;H 0.80 (d, J = 7.0 Hz, 3H)处有4个甲基。检测到5个亚甲基，包括一个delta;H 4.18 (d, J = 11.6 Hz, 1H)， 3.97 (d, J = 9.8 Hz, 1H)的氧合亚甲基，3个甲基和3个四元碳，包括一个delta;C 137.4 (C-5)， 126.5 (C-10)的双键。2D NMR数据表明，化合物1为5/6双环倍半萜，分子式为C15H26O(图1)。有趣的是，化合物1含有一个带两个甲基的季碳，这在倍半萜的环化机理中并不常见，需要进一步研究。

将化合物2提纯为白色粉末。1H和13C NMR数据表明，5个甲基在delta;H 1.83 (t, J = 1.2 Hz, 3H)，delta;H 0.96 (s, 3H)，delta;H 0.82 (s, 3H)，delta;H 0.80 (d, J = 7.0 Hz, 3H)，delta;H 2.06 (s, 3H)处发生了化学位移。鉴定出5个亚甲基，包括一个C-11处的酯化基团，其共振为4.64 (d, J = 11.6 Hz 1H)， 4.46 (d, J = 11.6 Hz, 1H)， 3个甲基，3个季碳，其中有一个delta;C 140.37 (C-5)， 122.04 (C-10)的双键。与化合物1的2D NMR信息相比，化合物2为C-11酯化1，分子式为C17H28O2(表S4，支持信息文件1)，这可能代表了萃取过程中的酯化反应。

本研究鉴定的5/6双环倍半萜为巴西烷型倍半萜,这种penoid类型通常是从担子菌Coltricia sideroides及其两个新烷烃衍生物colisiderderinA,(7E,9E)-undeca-7,9-diene2,4,5-triol[35]和红藻Laurencia obtusa[36]的有机提取物中分离出来的。然而，据我们所知，我们是第一个通过生物合成基因获得巴西烷型倍半萜的报道。

Tvi09626的金属离子依赖性及其动力学

正如之前报道的，大多数萜类合成酶在Mg2 离子存在时是有活性的[8,37]。为了检测Tvi09626对Mg2 的依赖性，我们进行了体外实验。GC-MS分析表明，在Mg2 存在的情况下，可以得到化合物1，而没有Mg2 或添加EDTA (2.5 mM)，则无法检测到化合物1(图5)。这表明Tvi09626是Mg2 依赖的倍半萜合酶。在动力学分析中，FPP酶的转化率(kcat)为(15plusmn;0.3)times;10minus;2，与omp6和omp7相似。它的底物亲和力(Km)为(0.44plusmn;0.11)times;10minus;6，是omp6的十分之一，是omp7的近四分之一。Tvi09626的催化效率(kcat/Km)为(35.32plusmn;0.57)times;103，高于omp6，低于omp7[21,38]。

图5 金属离子依赖性分析的GC-MS色谱图。

结论

综上所述，利用酿酒酵母YZL141的强倍半萜过量生产平台，从T. viride中鉴定出一个新的倍半萜合酶Tvi09626;这是首次从丝状真菌中鉴定出倍半萜合酶。经相对结构分析，该酶产物为5/6双环倍半萜化合物1,C-11氧合。有趣的是，在产物提取过程中分离出了酯化化合物1，表明这是一个酯化反应。它含有一个带两个甲基的季碳，这是倍半萜类化合物环化机理中少见的，需要在未来进行研究。据我们所知，本研究首次报道了利用生物合成基因获得巴西烷型倍半萜。

辅助信息

配套资料文件1实验部分及补充图表。[https://www.beilstein-journals.org/bjoc/content/补充/ 1860 - 5397 - 15 - 202 s1.pdf]

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