间谍环解密:利用异肽介导的环化来增强酶的热弹性的蓝图外文翻译资料

 2022-08-08 15:04:54

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第七章

间谍环解密:利用异肽介导的环化来增强酶的热弹性的蓝图

C.肖尼*，S.P.贝内特dagger;霍沃斯,m . *,1 *牛津大学，英国牛津__Sekisui诊断英国有限公司，梅德斯通，肯特，英国1通讯作者:e-mail: mark.howarth@bioch.ox.ac.uk

内容

1.介绍

2异肽键介导环化酶

2.1自发形成异肽键的伙伴

2.2与异肽键的环化

2.3环化酶的选择

2.4将感兴趣的基因克隆到间谍录音带中

2.5确认环化成功

3.SpyRing环化后酶弹性的表征

3.1植酸酶的产业相关性

3.2测量聚集体可以提供增加热弹性的证据

3.3恢复活度是测试热回弹时最重要的测量方法

3.4 FLuc是一个糟糕的间谍循环目标的例子

3.5动态扫描量热法是研究SpyRing环化的一个有用的生物物理工具

4.结束语

致谢

参考文献

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摘要

酶通常具有边缘稳定性，其展开通常导致不可逆变性。这种敏感性，无论是对新酶的发展和扩大酶的影响力使其超出实验室都是一个主要的障碍。为了寻找一种可以应用于一系列不同酶的增强变性弹性的方法，我们开发了SpyRing环化。SpyRings包含n端基因编码的SpyTag(13个氨基酸)和c端基因编码的SpyCatcher (12 kDa)

《酶学方法》580卷ISSN 0076-6879http://dx.doi.org/10.1016/bs.mie.2016.05.004

# 2016爱思唯尔保留所有权利。

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C. Schoene等。

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因此间谍伙伴能够自发地通过不可逆的异肽键反应在一起。SpyRing环化主要提高了热弹性，包括酶进化模型，beta;-内酰胺酶，以及农业和营养工业中重要的酶，植酸酶。我们概述了间谍的基本原理，其中包括间谍环化与其他环化策略的比较。我们在课题中也提出了简单插入酶基因进行重组表达的克隆策略。我们提出了基于结构的方法来选择合适的酶环化目标。介绍了环化反应的评价方法及其对酶弹性的影响。我们还强调了差示扫描量热法的使用以了解间谍环环化如何促进酶的再折叠。有效地搜索序列空间将依旧对酶的改进很重要，但间谍平台对提高酶的恢复力可能是一个有价值的合理助手。

1.介绍

理解如何扩大酶的使用范围是蛋白质工程的一个核心挑战。目前已有100多种酶在大规模工业应用，这些应用范围从洗衣粉和食品加工到化妆品行业(Li, Yang, Yang, Zhu， amp; Wang, 2012)。这一事实说明了酶的潜力。将有前途的酶从实验室推向大规模应用的主要难题包括生产成本高(Howard, Abotsi, Jansen van Rensburg， amp; Howard, 2003)和高温稳定性差(Lei, Weaver, Mullaney, Ullah， amp; Azain, 2013)。人们增强酶的热弹性最常见的策略是基于结构或基于文库，但这些方法通常是在个案基础上执行的(Packer amp; Liu, 2015;杨柳，李辰，杜，2015)。

为了确定增强稳定性的通用方法，许多科学家已经开始探索蛋白质环化。蛋白质环化是将蛋白质的N端和c端共价捆绑在一起，从而降低蛋白质两个最易移动部分的灵活性，同时降低展开时的熵增益(Schumann et al.， 2015)。先前的蛋白质环化工作利用了碳二亚胺交联(Goldenberg amp; Creighton, 1983)、分裂蛋白(Camarero amp; Muir, 1999;Evans, Benner， amp; Xu, 1999;Iwai amp; Pleuro;uckthun, 1999年;Scott, Abel-Santos, Wall, Wahnon， amp; Benkovic, 1999)和sortase (Parthasarathy, Subramanian， amp; Boder, 2007)。在某些情况下，热弹性的增加已经被记录(Antos等人，2009;Iwai amp; Pleuro;uckthun, 1999年;Popp, Dougan, Chuang, Spooner， amp; Ploegh, 2011;van Lieshout等人，2012)。

我们已经开发了一种基于自发的异肽键形成的方法来环化蛋白质，该方法已经能够实现gt;60°C的热弹性增加(Reddington amp; Howarth, 2015;Schoene, Bennett， amp; Howarth, 2016;Schoene, Fierer, Bennett， amp; Howarth, 2014)。

2异肽键介导环化酶

2.1自发形成异肽键的伙伴

我们已经开发了一系列不同的能够不可逆反应的肽/蛋白对。故事开始于泰德·贝克的团队解开了源于化生链球菌的一个pilin亚基Spy0128的晶体结构，他们发现赖氨酸和天冬酰胺侧链之间的两个结构域的每一个都形成了异肽键(Kang, Coulibaly, cllow, Proft， amp; Baker, 2007)。Spy0128的质谱分析验证了异肽键的形成，而突变分析证实了该键形成所需的三个残基(Kang et al.， 2007)。我们能够将Spy0128的c端beta;链分裂成一个16个氨基酸的标签，称为异肽标签。Spy0128的18-299残基分别表达被命名为Pilin-C。通过将Isopeptag与麦芽糖结合蛋白(MBP)进行基因融合，我们发现Isopeptag-MBP可以与Pilin-C重组并形成异肽键(Zakeri amp; Howarth, 2010)。

我们进一步的工作是寻找比Pilin-C/Isopeptag更快和更小的反应对。化生葡萄球菌的纤维连接结合蛋白(FbaB)的CnaB2域被发现在天冬氨酸和赖氨酸之间形成自发的异肽键(Hagan et al.， 2010;Oke等，2010)。SpyTag是一种包含活性天冬氨酸残基等13个氨基酸的肽，其由CnaB2结构域的c端beta;链以及随后的5个未包含在晶体结构中的FbaB残基组成。CnaB2的剩余部分生成SpyCatcher，并通过使两个暴露的疏水残基突变进一步优化(图1A)。SpyTag-MBP能够有效地与SpyCatcher(二阶速率常数1.43 米“1秒”1)在各种缓冲液中发生反应，包括在还原或氧化条件下(Zakeri et al.， 2012)。接下来，我们发现了SpyTag/SpyCatcher的正交对。肺炎链球菌RrgA黏附素D4结构域具有赖氨酸和天冬酰胺侧链之间的异肽键(Izor'e et al.， 2010)。

被裂解的含有反应性赖氨酸残基(734-745残基)的n端beta;链被命名为SnoopTag。残基749-860提供了SnoopCatcher，课题组通过突变两个残基进一步优化其稳定的二级结构。SnoopTag/SnoopCatcher和SpyTag/ SpyCatcher被发现相互之间没有反应。两种标记/捕获系统的联合使用使得构建序列编程蛋白链成为可能(Veggiani等人，2016)。

图1使酶环化的SpyTag和SpyCatcher。（B）将FbaB的CnaB2域划分为SpyTag和SpyCatcher。基于PDB 2X5P的漫画(Oke et al.， 2010)。SpyRing基因结构的表达导致体内环化。异肽键的形成依赖于三个显示的残基:Lys和Asp之间的反应由相对的Glu促进。（C）提出了spyring介导的热弹性原理，通过支持原生(N)和未展开的中间态(Uint)，避免了向未展开的聚合态(Uagg)。

2.2与异肽键的环化

我们最初对这些肽/蛋白连接工具的研究都集中在锁定不同蛋白质单位的机会上(Fairhead等人，2014;菲勒，Veggiani， amp; Howarth, 2014;Veggiani等人，2016年)。然而，高效的反应和灵活的标记定位为我们提供了利用这些成对的工具来驱动分子内反应的机会。SpyTag/SpyCatcher (SpyRing，图1B)、Pilin-C/ isoopeptag (PilinRing)和SnoopTag/ SnoopCatcher (SnoopRing)均显示能有效环化beta;-内酰胺酶(BLA) (Schoene et al.， 2016)。与未标记组对照相比，所有这些环化结构主要表现出增强的热弹性。我们将Pilin-C、SpyTag和SnoopTag放置在BLA的n端，将Isopeptag、SpyCatcher和SnoopCatcher放置在BLA的c端，但我们没有验证将这些组件调换是否会更好。因此，对于捕手来说，标签是应该在N端还是c端还需要进一步的研究，反之亦然。然而，我们发现SpyRing cyclation可以最大程度地增强恢复力(Schoene et al.， 2016)，因此这种方法将是本章的重点。这样的比较以及线性控制测试，显示了SpyRing的弹性是如何从简单的环化或融合到超过耐热域的(Schoene et al.， 2016, 2014)。我们提出了一种机制，即SpyRing环化通过阻止不可逆的变性后促进酶的重新折叠使其转变为展开的聚合体，从而提供弹性(图1C) (Schoene et al.， 2016, 2014;舒曼等人，2015)。

我们描述了环化的合适酶靶的选择，它们的插入间谍结构以及用于验证成功环化的方法。此外，我们重点研究了beta;-螺旋桨植酸酶(PhyC)的环化，以及酶学、溶解度和生物物理表征方法，这些方法可用于研究spyring环化蛋白。

2.3环化酶的选择

间谍环化是一种简单的稳定不同酶的方法。在两周内，我们可以从获取感兴趣的酶的DNA到测试监视酶的热弹性。然而，我们假设以下标准在确定间谍环化候选酶时是有帮助的。如果酶的结构(或相近的同系物)是有用的

需要考虑:N-端和c端之间的距离，活性位点是否与端在同一面上。

SpyRings环化酶弹性

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我们认为，在N端和 c端之间距离较短(lt; 15a˚)且活性位点与两端不紧密相连的酶是进行SpyRing环化的理想候选酶。在这种情况下，我们的经验是，间谍环化几乎没有改变酶的活性。对于BLA(从N到c端为7˚)，我们显示了kcat 的最小差异或者Km (Schoene et al.， 2016)介于野生型和间谍型之间。我们已经调查了蛋白质数据库中端粒的分布(Krishna amp; Englander, 2005)，很大一部分的单结构域蛋白应该基于这个距离标准。然而，即使像在PhyC中那样端部间隔为29 A，我们也获得了高效的SpyRing环化并提高了热弹性(Schoene et al.， 2016)。

先前成功的其他环合方法以及环状排列或二硫键工程，也可能增强间谍环合工作的信心。蛋白素介导的BLA环化导致#5°C的聚集抗性增加(Iwai amp; Pleuro;uckthun, 1999)。二氢叶酸还原酶(DHFR)此前已通过氰半胱氨酸介导的环化作用得到稳定(Takahashi等，2007)。我们能够证明，DHFR和BLA通过SpyRing环化都具有弹性(Schoene et al.， 2014)。然而，如果没有关于环化的数据，那么就有必要搜索文献，看看该酶与另一种蛋白质融合时是否仍保持活性，或者与耐热蛋白融合是否会增加热弹性(Pierre, Xiong, Hayles, Guntaka， amp; Kim, 2011)。

间谍性的环合作用不太可能取代纸面环合作用。如果蛋白质需要伴侣来折叠或去折叠，如RuBisCO (Liu et al.， 2010)或萤火虫荧光素酶(FLuc) (Svetlov, Kommer, Kolb， amp; Spirin, 2006)，间谍环化可能不是正确的方法。酶辅助因子也可能导致并发症，特别是当一种酶在一种辅助因子缺失后不能正确折叠时，如葡萄糖氧化酶(Zoldaacute;k, Zubrik, Musatov, Stupaacute;k， amp; Sedlaacute;k, 2004)。

到目前为止，我们主要研究的是单体酶。稳定多聚蛋白质的一般策略需要进一步的研究。

2.4将有益的基因克隆到间谍表达盒子中

间谍环化是通过将SpyTag基因编码在n端，将SpyCatcher基因编码在c端实现的。然后表达的结构能够自发地在表达细胞内形成异肽键(图1B)。因此,SpyRing环合需要在间谍表达盒中插入酶的开放阅读框。

为了找到一种快速、可靠和模块化的方法来将不同的酶插入SpyRing盒中，我们设计了一种独立于连接的克隆策略(图2)。克隆方法需要两个定制的引物来适应酶的编码序列。定制引物的尾部区域可以与载体杂交。50尾区为27 bp, 30尾区为23 bp，这两个区域都与矢量序列重叠。这种方法通过在酶的两侧产生甘氨酸/丝氨酸间隔区(GSGGSG)，以促进SpyTag/SpyCatcher高效的环化，并最大限度地减少对酶折叠的干扰。用于扩增载体序列的模板可以从Addgene质粒库(ID: 52656)中轻易获得。一旦插入物和载体被扩增和纯

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