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L-苏氨酸醛缩酶用于不对称合成beta;-羟基-alpha;-氨基酸

重点

bull;从活跃的Actinocorallia herbida提取L-苏氨酸醛缩酶。

bull;不同类型的芳香醛对AhLTA有显著影响。

bull;4-甲磺酰苯甲醛的用量影响AhLTA的立体选择性。

bull;在这项研究中提出了一种可能的调节机制。

摘要

L-苏氨酸醛缩酶(L-threoninealdolase，LTA)是一种5′-磷酸吡哆醛（PLP）依赖的酶，能可逆催化甘氨酸和乙醛的醛缩反应生成beta;-羟基-alpha;-氨基酸。在本研究中，从草食放线菌(Actinocorallia Grassida，AhLTA)中挖掘出一个推测的lta基因，并在Escherichia coli BL21(DE3)中过表达。底物谱实验表明，AhLTA仅以甘氨酸为供体底物，并能耐受广泛的芳香醛作为受体底物。研究发现，芳香醛中取代基的种类和位置对AhLTA的beta;-碳活性和立体选择性有显著影响。其中，AhLTA催化甘氨酸和4-甲基磺酰基苯甲醛(14a)生成L-threo-4-甲基磺酰基苯丝氨酸(2S，3R)-14b，转化率高(94.4%)，立体选择性中等(19%de)。通过条件优化，(2S，3R)-14b的de提高到61%，转化率为75%。综合以上，我们的研究认为AhLTA可能是制备手性beta;-羟基-alpha;-氨基酸的很有前途的催化剂。

关键词：不对称合成；苏氨酸醛缩酶；beta;-羟基-alpha;-氨基酸；底物特异性；优化

1.绪论

beta;-羟基-alpha;-氨基酸属于非蛋白氨基酸的重要亚类，具有抗微生物，抗肿瘤和免疫抑制活性。例如，3-羟基亮氨酸异构体是几种天然肽抗生素的中间体。苯丝氨酸及其衍生物可用于万古霉素的合成，氟苯尼考和甲砜霉素。此外，L-threo-3,4-二羟基苯基丝氨酸（L-DOPS）可以直接作为治疗帕金森氏病的重要药物。结果，由于beta;-羟基-alpha;-氨基酸在化学合成和药物生产中的重要作用，引起了广泛的关注（图1）。

图1生物活性化合物中的beta;-羟基-alpha;-氨基酸结构单元。

beta;-羟基-alpha;-氨基酸存在两个手性中心和四个异构体，使其难以合成光学纯的beta;-羟基-alpha;-氨基酸。到目前为止，已经致力于控制包括动态动力学拆分，有机催化不对称醛醇缩合反应和Sharpless不对称双羟化，氨基羟基化或环氧化的大量化学策略来控制beta;-羟基-alpha;-氨基酸的立体化学。尽管这些合成路线取得了巨大成功并促进了beta;-羟基-alpha;-氨基酸的工业化生产，但是仍然存在一些问题，包括对两个手性中心的立体选择性不足和昂贵的手性助剂，需要额外的耗时步骤来保护和去保护官能团，并造成重金属废物的产生，这违反了绿色化学原则。

与传统的有机化学合成相比，生物催化是在温和条件下和高度立体化学控制下合成beta;-羟基-alpha;-氨基酸的强大辅助工具。而且，beta;-羟基-alpha;-氨基酸的生物合成是一步过程，并且产生较少的副产物。一个明显的例子是苏氨酸醛缩酶，它是5′-磷酸吡哆醛（PLP）依赖性酶，可以通过低价值原料一步一步地指导可逆催化C-C键的不对称形成和两个立构中心的功能化。此外，苏氨酸醛缩酶在自然界普遍存在，可以从许多细菌，酵母和真菌中提取。这些优点使苏氨酸醛缩酶成为合成非天然化合物或药物前体的诱人工具。苏氨酸醛缩酶根据其在苏氨酸的alpha;-碳上的立体特异性而分为L型和D型，并且可以根据其在苏氨酸的beta;-碳上的立体特异性而进一步分为三个亚型。例如，LTA可以被归类为L-苏氨酸醛缩酶（LTA，EC4.1.2.5），L-allo-苏氨酸醛缩酶（L-allo-TA，EC4.1.2.49）和L-低特异性苏氨酸醛缩酶（L-low-TA，EC4.1.2.48）。对于DTA，迄今为止仅发现了D-低特异性苏氨酸醛缩酶（D-low-TA，EC4.1.2.42）。

尽管苏氨酸醛缩酶合成beta;-羟基-alpha;-氨基酸具有明显的优势，但是，产物转化不足和对beta;-碳的适度立体选择性性能的缺点无疑妨碍了它的进一步应用。例如，LTA对alpha;-碳表现出出色的立体选择性（gt;99％ 对映体过量，ee），而对beta;-碳的立体选择性表现（非对映体过量，de）适中。据报道，当将反应保持在动力学控制下时（通常在低温和少量酶的条件下），DTA具有很高的立体选择性。然而，迄今为止，大多数工业化的活性中间体是L-苏氨酸异构体，只有LTA生产。迄今为止，几乎所有通过蛋白质工程来提高TA的Cbeta;立体选择性的尝试都是徒劳的。因此，挖掘新的LTA可能是目前解决“Cbeta;-问题”的主要方法。在本工作中，草食放线菌(ActinocoralliaGrassida，AhLTA)的LTA被鉴定为能以甘氨酸为特异性供体底物，以芳香醛为受体底物。在优化条件下，AhLTA对4-甲基磺酰基苯甲醛(14a)具有较高的催化活性，L-threo-4-甲基磺酰基苯基丝氨酸((2S，3R)-14b)的转化率和de分别为77%和61%。我们的研究表明，AhLTA可能是制备beta;-羟基-alpha;-氨基酸的一种很有前途的生物催化剂。

2.材料与方法

• 1. 材料

分别以pET28a和Escherichia coli BL21(DE3)为表达载体和宿主菌。酵母醇脱氢酶(ADH)、5′-磷酸吡哆醛(PLP)和烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NADH)，购自中国阿拉丁。(2S，3R)-14b乙酯(CAS#：36983-12-7)标准品购自上海远业生物技术有限公司，将(2S，3R)-14b乙酯溶于氢氧化钠溶液中得到(2S，3R)-14b。O-邻苯二甲醛(OPA)、N-乙酰半胱氨酸(NAC)均购自Sigma-Aldrich(美国)，除非另有说明，本工作所用其他所有化学物质和试剂均为市售，纯度最高。

• 1. L-苏氨酸醛缩酶的克隆、过表达及纯化

武汉吉恩生物工程有限公司对草食动物( Actinocorallia herbida )L-苏氨酸醛缩酶（AhLTA，GenBank NO.ROO84520）的DNA序列进行了优化和合成，并连接到质粒pET28a，然后将重组质粒转移到E.coil大肠杆菌BL21（DE3）。将含有pET28a-AhLTA质粒的细胞在含有50mu;g/mL卡那霉素的Luria-Bertani培养基中于37℃恒定振荡培养。当OD_600nm达到0.6–0.8时，加入200micro;M异丙基beta;-D-硫代半乳糖苷（IPTG），在20℃下进一步培养16h。细胞通过离心在6000克收获下4℃，并通过1/10体积的磷酸盐缓冲溶液（PBS）（25mM的重悬的NaH₂PO₄，200mM的氯化钠，25mM的咪唑，pH7.0）中。通过超声破碎细胞，并根据说明手册通过Ni-IDA预装柱纯化可溶性AhLTA。将纯化的酶交换到存储缓冲液（25mM的NaH₂PO₄，10％甘油，pH7.0），并进一步通过十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）。使用BCA蛋白质检测试剂盒测定蛋白质浓度。

• 1. 活性测定

如前所述，NADH与酵母乙醇脱氢酶(ADH)偶联，测定了AhLTA的反羟醛活性。使用MultiskanGo酶标仪在25℃下监测340nm处(ε=6220M^-1cm^-1)吸光度的下降，检测NADH的氧化情况。在25℃的Britton-Robinson缓冲液中加入50mM L-苏氨酸、50mu;M PLP、200mu;M NADH和5U ADH(190mu;L)，加入10mu;L适当稀释的酶液，在340nm波长下反应1min。以煮沸的酶样品作为阴性对照。反羟醛活性单位(U)定义为每分钟催化1mu; mol L-苏氨酸裂解的酶量。所有实验均分3次进行。

• 1. 动力学参数的测定

通过测量在不同浓度的苏氨酸（0.1-100mM）下酶促反应的初始速率来确定动力学参数。对每种浓度的苏氨酸测定进行三个独立的重复，并将数据拟合至Michaelis-Menten方程。

• 1. 温度和pH值对AhLTA稳定性和活性的影响

L-苏氨酸用作活性测定的底物，Britton-Robinson缓冲溶液用作缓冲液。通过测定各种pH值（pH4.0-pH10.0）和温度（10℃-80℃）下的活性，研究了pH和温度对酶的影响。通过在4℃下于各种pH值（pH4.0-pH11.0）的缓冲液中孵育过夜后，测试室温下的剩余活性来评估AhLTA的pH稳定性。对于AhLTA的热稳定性，在不同温度（10-80℃）下孵育30分钟后，在室温下测量酶的剩余活性。

• 1. 金属离子对AhLTA活性的影响

还研究了金属离子对AhLTA的影响，在终浓度为1mM的情况下，在不同金属离子存在下测量了酶的活性，并将无金属离子的反应作为空白对照，所有实验均一式三份进行。

• 1. AhLTA的手性衍生化分析

初始反应混合物以1mL体积进行，包括1mL PBS（100mM）中的100mM 4-甲基磺酰基苯甲醛，1M甘氨酸，50micro;M PLP和AhLTA（50mg/mL湿细胞，约10mg/mL干细胞），pH7.0，30％乙腈）。反应后，将反应混合物用9mL的MeOH稀释，并在4℃下储存过夜以沉淀未反应的甘氨酸。在用邻苯二甲醛/ N-乙酰半胱氨酸（OPA/NAC）手性衍生后，通过HPLC将上清液用于检测产物的转化和立体特异性（Molnar-Perl，2001）。将HPLC的流动相[KH₂PO₄溶液（50mM，pH8.0）/CH₃CN=79/21]的流速设为1mL/min。

• 1. 供体和受体底物特异性

通过使用L-丙氨酸，L-丝氨酸和甘氨酸作为供体，而4-甲基磺酰基苯甲醛（14a）作为受体来评估AhLTA的供体底物特异性。对于受体底物特异性，分别选择一系列芳族醛（表2中的条目1-24）和甘氨酸作为受体和供体。OPA/NAC衍生化后，通过分析型HPLC检测反应混合物。

表1AhLTA的动力学参数

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