一种新的酶催化大肠杆菌中的维持生命的反应外文翻译资料

 2022-08-08 15:14:58

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一种新的酶催化大肠杆菌中的维持生命的反应

摘 要

产生在体外具有催化活性和在体内具有生物功能的新酶是合成生物学的关键目标。 在这里，我们描述Syn-F4， 第一个符合这两个标准的新蛋白。 纯化的Syn-F4水解铁载体铁肠杆菌素，Syn-F4的表达使大肠杆菌在铁限制培养基中生长。 这些发现表明，全新的序列可以提供活生物体的维持生命的酶功能。

正文

新序列人工蛋白文库可以为发现具有化学和生物学重要功能的新蛋白质提供丰富的多样性来源。为了实现这一目标，我们已经使用极性和非极性氨基酸的二元模式来产生可折叠成稳定的alpha;-螺旋结构的序列库3,4。为了从这些文库中分离出具有功能的蛋白，将新序列的合成基因转化到在基础培养基上缺少一种生长所需必要条件的大肠杆菌的营养缺陷菌株中，结果成功修复了几个这样的基因缺失，表明与自然序列不相干的新蛋白质可以提供维持生命的功能。之前，我们报道了其中两种新的蛋白质拯救了磷酸丝氨酸磷酸酶和柠檬酸合酶(分别serB 与gltA编码)的缺失，不是通过催化缺失的功能，而是通过改变突变株的基因调控与/或代谢。6,7

使用人工蛋白重新连接基因代表了合成生物学的一 大进步；然而，能否发现一种新的蛋白质，作为一种真正的酶来维持细胞的生长，显然更具挑战性8. 为了应对这一挑战，我们专注于修复fes缺失的二元模式蛋白，fes编码铁肠杆菌素(FeEnt)酯酶。Delta;fes菌株不能在铁受限的环境中生长，因为铁通过与肠杆菌素(Ent)铁载体紧密结合而被隔离 在野生型菌株中，FES蛋白水解 FeEnt，从而释放铁供细胞使用(Fig. 1a). 在早期的工作中，我们描述了几种拯救Delta;fes的新蛋白5. 然而,Delta;fes表达这些新生蛋白的细胞在富铁培养基中呈明显的红色，表明新生蛋白几乎不能被检测到水解红色FeEnt铁载体(lambda;max = 495 nm)。此外，我们无法在体外检测水解活性。因此，无论在体内还是体外，这些蛋白质似乎都没有明显的酶活性。

图1:Syn-F4催化铁肠杆菌素的体内外水解。

铁肠杆菌素(FeEnt)被天然Fes水解形成三个线性产物(三聚体、二聚体和单体)。(b) Delta;fes大肠杆菌表达进化的新生蛋白Syn-F4、亲本新生蛋白Syn-IF和天然大肠杆菌Fes蛋白的菌落表型。小的红色菌落表明FeEnt的生长和积累缓慢;大的白色菌落表明FeEnt的旺盛生长和降解。(c)通过高效液相色谱法(HPLC)监测，FeEnt经Syn-F4水解后，显示FeEnt的分解产物为铁载体的天然l -对映体。Ent enterobactin;T,三聚物;D二聚体;米,单体。实验结果表明，缓冲液在不含蛋白质的情况下不能催化FeEnt的降解。(d) Syn-F4对FeEnt的非天然d -对映体无活性。A316

我们之前描述了一种名为Syn-IF的蛋白质，它拯救了Delta;fes和Delta;ilvA(因苏氨酸脱氨酶缺失)菌株9。当我们将双功能Syn-IF蛋白进行随机突变，然后选择在最低限度铁培养基中更加快速地拯救Delta;fes细胞时，我们观察到表达进化变异Syn-F4(合成蛋白拯救Fes，第4代)的Delta;fes细胞在最低限度培养基板上生长得更快。这些细胞在最小液体培养基中的生长曲线也显示出明显的改善。此外，在富培养基上，Syn-F4赋予Delta;fes细胞一个新的表型:表达Syn-F4的细胞形成白色较大单点菌落，与表达野生型大肠杆菌Fes酶的细胞相似，而不是形成红色较小菌落，这表明FeEnt生长缓慢和积累缓慢(图1b)。值得注意的是，表型由红色变为白色表明Syn-F4在体内催化FeEnt酶解。

为了确定纯化的Syn-F4蛋白是否具有酶解能力，我们表达了人工蛋白(在Delta;fes细胞中，以防止天然Fes污染)，并使用离子交换和凝胶过滤层析纯化。然后用LC MS检测Syn-F4对FeEnt的降解能力。如图1c所示，纯化的Syn-F4水解FeEnt得到三聚体、二聚体和单体分解产物。降解产物的分子量表明，Syn-F4水解FeEnt产生的产物与天然大肠杆菌酶Fes相同。此外，LC - MS观察到的时间过程与与FeEnt降解相关的红色视觉损失相关。相比之下,Syn-IF Syn-F4—然而祖先,显示没有检测到活动在48 h。通过监测FeEnt的消失在一系列酶和底物的浓度,我们观察到反应速率下降随着酶浓度降低,并计算每小时约0.6催化转化率。虽然这一速度比大多数天然酶要慢得多，但细胞不需要高水平的FeEnt酯酶活性，而天然Fes酶仅快出1000倍。

天然酶的特征之一是对映选择性。为了确定从头设计的人工酶是否也具有对映选择性，我们测试了sync - f4水解天然铁载体合成的对映体d -肠杆菌素的能力。如图1d所示，Syn-F4不降解铁 D-肠杆菌素。因此，从头设计的酶类似于天然酶因其特异性自然发生的手性底物。

在上述实验中，在高拷贝质粒上的强启动子过表达从头蛋白的条件下，Syn-F4维持了Delta;fes细胞的生长。接下来，我们想知道这种具有极低周转率的新酶，是否能够在大肠杆菌染色体上天然铁调控的fes启动子上表达时维持生长。为了解决这个问题，我们用编码Syn-F4的合成基因取代了天然fes序列，并检测了在最小培养基上的生长。这些Delta;fes::Syn-F4细胞在5天内形成集落，比从质粒中过表达Syn-F4所需的2天要慢，这并不奇怪。虽然依赖于染色体表达的Syn-F4的细胞比依赖原有铁元素的同样的细胞生长得慢。这些结果表明，编码一种新酶的基因的染色体掺入可以产生具有维持生存能力的半人工基因组。

Syn-F4是基于非自然序列的对映选择性酶的第一个例子， 该酶在体内提供了必需的生物活性。 然而，Syn-F4的序列（见补充说明2）与它所取代的酶没有相似性，因此其活性 位点不容易明显。 对于天然酶，探测活性位点的标准方法通常依赖于(I)来自其他生物的同源序列的生物信息学比较 和(Ii)结构确定。 然而，对于Syn-F4，这两种标准方法都不合适。 首先，从定义上讲，新蛋白与来自自然生物的序列无关，其次，先前的工作表明，Syn-F4与来自同一新设计 文库的其他蛋白质一起，形成了一种动态结构，在单体和二 聚体 -螺旋结构之间平衡(补充图。 2)11. 因此，尽管使用晶体学和核磁共振进行了广泛的尝试，但我们在确定结构方 面没有成功。然而，幸运的是，最近在诱变、高通量测序和 计算建模方面的进展为评估哪些残基对活性很重要提供了一 种替代方法12–14。

我们没有比较同源的自然序列，而是使用容易出错的PCR创建了大量新序列，这些新序列与Syn-F4平均每个序列相差13个残基。这些序列在Delta;fes细胞中表达，在富铁培养基上电镀，并评估集落表型，以检测其体内催化活性(补充图1a)。如上所述，菌落的颜色与体内的酶活性相关:未裂解FeEnt积累时菌落为红色，而在体内表达的从头设计蛋白水解产生白色菌落。因此，从白色菌落中分离出来的序列应该显示出在酶功能必需的残基上的氨基酸保护。我们挑选了6000个白色菌落进行高通量测序，发现在102个残基的蛋白质中，只有27个氨基酸高度保守(图2)。其中15个是甘氨酸、谷氨酸和亮氨酸，我们认为这些氨基酸对结构而不是酶的作用很重要。其他12个保守的残基是极性的或带电荷的，是很好的催化位点候选。接下来，我们对这12个极性或带电残基进行饱和诱变，并选择在最小培养基上进行拯救，在丰富培养基上选择白色表型(表明酶活性)。这些选择实验发现了Glu26、His74、Arg77、Lys78和Arg85五个残基，它们被其他氨基酸取代后导致功能缺陷(补充图1b)。

图2:Syn-F4的突变显示了保守的残基。

（通过高通量测序对功能Syn-F4突变体的残基保守进行了分析。黑条和粗体表示27个高度保守的位置。其中12个是极性的或带电荷的，其余15个是甘氨酸、丙氨酸或亮氨酸。）

这些诱变研究的结果随后被用于指导计算结构预测。由于凝胶过滤分析显示，在具有催化活性的浓度下，synf - f4形成了二聚体(补充图2)，我们使用Rosetta15中的折叠和Dock协议来预测二聚体的结构。初步预测了几种低能二聚体构象。然而，当计算被限制为将5个不可变残基彼此靠近时，我们倾向于选择一种结构(补充图3)。将FeEnt对接到这个结构中表示一对对称，明确的活性位点，包括一个被带电残基包围的非极性口袋，既可以锚定底物，又可以催化FeEnt的水解。

预测的Syn-F4的结构(补充图3)与它所取代的酶的结构有很大的不同。大肠杆菌铁限制酶(43 kDa)具有alpha;beta;水解酶折叠，并使用Ser-His-Glu催化三聚体水解FeEnt10。相比之下，Syn-F4是一束alpha;-螺旋，不包含丝氨酸残基，可能作为催化亲核试剂。因此，我们考虑了催化的其他可能性。实验表明，高浓度的咪唑可以催化FeEnt水解，咪唑是一种类似于组氨酸的小分子，能够水解酯键16。这导致我们提出了一个包含上述保守残基的催化位点，其中Glu26与His74的tau; NH相互作用，从而增加组氨酸环另一侧的pi;-N的碱度，使其对FeEnt的酯羰基进行碱催化水解。Syn-F4不能催化铁酸d -肠杆菌素的水解，这一发现支持了我们预测的结构。尽管L和D版本的底物具有相同的化学性质(形状、大小和反应活性)，但它们会将酯键置于相对于提议的活性位点的不同位置。

理论上，Syn-F4在体外是一种对映选择性FeEnt酯酶，但在体内通过其他一些(非酶)机制挽救了Delta;fes细胞。事实上，我们之前的研究结果表明，在氨基酸生物合成途径中，其他人工蛋白发挥调节功能来拯救缺陷营养生物6,7，这使得我们考虑Syn-F4在体内可能没有酶活性。然而，FeEnt底物的红色便于在体内和体外直接观察FeEnt酯酶活性。在体外，LC-MS结果显示酶活性(图1c)与可见红色的丧失相关(图1b)。同样，在体内，拯救的功效与与FeEnt底物细胞内降解相关的红色丧失相关。如图2和补充图1所示，我们检测了Syn-F4数千个突变的表型。那些获救的Delta;fes上铁有限的最小介质具有与天然Fes酶相同的功效，促进在丰富的培养基上茁壮生长(大菌落)。这些菌落也是白色的，表明FeEnt水解。相反，导致在最低培养基上比天然Fes酶生长更慢的变异在富培养基上产生小菌落。这些菌落呈红色，表明有未裂解的FeEnt聚集。因此，无论突变体是活跃的还是不活跃的，遗传拯救(在最小培养基上观察到的生长)与体内的酶活性(观察到的菌落颜色)相关。

本文所描述的结果表明，一种新的蛋白质，既不是由计算机设计的，也不是通过数十亿年的进化来选择的，可以提供一种维持细胞生长的酶功能。 此外，这种蛋白质使用与自然选择的序列、结构和机制有很大不同的序列、结构和机制 来解决生化挑战。 作为生物活性新酶的第一个例子，Syn-F4加入了其他三个二元模式的人工蛋白，这些蛋白先前被证明可以通过非催化机制维持细胞生长6,7,17。这四种蛋白质共同表明，生物学上的挑战可以通过与自然进化本质上不同的分子和机制来解决。此外，这些序列可以被视为迈向提供维持生命所需功能的人工蛋白质组的第一步。

研究方法（手段）

试剂

分别在丰富培养基(Luria Broth)和微量培养基(m9 -葡萄糖)中添加氯霉素(Cam)和卡那霉素(Kan) 30 mu;g/mL，用于质粒和菌株维持。Enterobactin从Delta;fesDelta;fur e.c oli中分离得到，在添加了铁(III)氯离子(100 mu;M)的最小培养基中生长;隔离技术在别处描述18。在反应缓冲液(75 mM HEPES 100 mM NaCl, pH = 7.5)中，将在DMSO中溶解的apo肠杆菌素与1.1等量的FeCl3混合，在4℃下孵育1 2 h。

菌株与质粒

大肠杆菌单基因敲除菌株(Delta;gene::kan)来自大肠杆菌遗传库中心(http://cgsc.biology.yale.edu)。采用标准P1转导方法构建双敲除菌株(Delta;gene1Delta;gene2::kan) 19。如前所述，编码新生蛋白或对照的基因位于iptg诱导的修饰pCA24N载体(p3glar)中，该载体含有氯霉素抗性基因。

生长与表现型分析

生长和表型分析。拯救质粒和对照质粒转化为Delta;fes大肠杆菌，并分别在含有或不含异丙基beta;- d -1-硫代半乳糖吡喃苷(IPTG)的富(LB)和极少量(m9 -葡萄糖)平板上被镀上;50mu;M)。这些培养皿在33℃下生长，并每天监测其生长情况。在含有IPTG的富培养皿中，培养24 h内菌落颜色明显。这些被孵育了额外的一天，以允许进一步的颜色发展。在极小的平板上，Delta;fes与野生型Fes转化的细胞一样，在2d内形成菌落。

蛋白表达与纯化。

一个单菌落接种在培养基上成长在37 C 12 h。这是用来接种1 L的富

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