金与槐糖脂构建的糖基化表面的杀菌特性外文翻译资料

 2022-08-08 15:52:48

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金与槐糖脂构建的糖基化表面的杀菌特性

摘要：经典的抗菌涂层通常运用抗黏附和生物杀灭策略来达到抗菌目的。糖基化表面就是通过抗黏附机制被用来防止生物膜的形成。我们报道的第一个有杀菌特性糖基化表面的例子，是通过槐糖脂（通过糖苷键与油酸链接的槐糖单元）与金表面短氨硫醇的自组装单层（SAM）共价接枝产生的。通过显微镜观察、荧光染色和细菌生长试验等多种技术的联合运用，评估了这些表面对革兰氏阳性细菌的杀灭作用。大约50%的细菌由于细胞膜改变而丧失活性。此外，槐糖单元与脂肪链结构的抗菌作用可以通过由没有槐糖的油酸和有饱和脂肪链的槐糖衍生物所修饰的没有活性的基底突显出来。因此，这一系统证明了碳水化合物在细菌细胞膜失稳和破坏中的直接作用。

关键词：槐脂、糖脂、表面功能化、自组装单层、抗菌涂层、触杀、杀菌机理

引言：表面的生物污染是医疗与制药行业、食品加工设施、水管、舰艇以及纪念碑和文化遗产材料等方面所面临的主要问题。细菌、真菌和藻类都倾向于在固体表面附着并生长，通过形成生物膜而导致一些我们所不期望的现象发生，如粘附性能丧失、降解、感染等等。表面污染会造成巨大的社会经济影响。例如， 在2002年，美国的医院感染人数据估计有170万，其中因此丧命的仅略少于10万人。此外，生物膜中的细菌通常更具抵抗力，因此长期内抗生素对其无效。为了防止这些问题，人们进行了大量的研究，运用了防黏附或生物杀灭策略，来开发可以应用与物体表面的预防性抗菌涂层。最后，人们主要发现了通过接触杀灭或通过释放杀灭这两种方法，其中的活性物质，例如抗生素、季铵盐衍生物、纳米粒子等，要么混合在基底中，要么沉积在基底上，要么化学接枝在表面。然而，其中大多数化合物的生态毒性、微生物耐药性的增加或接枝策略的复杂性限制了它们在大范围内的实际应用。生物衍生化合物，例如酶、抗菌肽或能够干扰群体感应现象的分子等，由于其具有广泛的作用范围、低浓度下的效率以及缺乏细菌耐药性而成为吸引人的替代品。然而，其合成纯化的高成本、对PH的敏感性、蛋白水解的敏感性及重复使用后潜在的局部毒性和过敏反应可能会限制其的使用。

在这种情况下，作为生命系统中最常见的化合物之一，碳水化合物由于其在医疗和制药相关领域的大量应用，例如疫苗和抗癌药物，用于抗体识别和细胞粘附的糖蛋白阵列的制备，抗生物膜和抗菌制剂等等，越来越引起人们的兴趣。即使单独的糖水化合物是微生物营养物质的来源而不是杀菌化合物，一些报道仍提到了含糖分子的抗菌作用，例如从大肠杆菌中提取的胞外多糖以及很少一部分由人工合成或天然的通过碳水化合物共价结合一个有机部分（从简单的烷基链到更复杂的结构）的糖化合物。例如，一种从结节链霉菌中提取的复杂糖脂两性霉素B，被用来治疗真菌感染以及其他化合物展示出来的有趣的抗菌性能。直到现在，仅有两种碳水化合物衍生物的抗菌作用形式被阐述出来：（1）通过溶液中的糖脂促进细胞溶解来杀菌，（2）抗黏附作用，通常观察到的多糖或糖脂要么固定在基底上（糖基阵列），要么游离在溶液中。尽管这些作用机制仍然存在很大争议，糖脂的杀菌作用可能是其具有两亲性，这使其可以穿透生物质膜，从而导致细胞溶解及胞质泄露。因为既不是纯碳水化合物，也不是常见的脂类，而是像脂肪酸具有特别的杀菌性能 这种杀菌性能通常被称为“表面活性剂效应“，其在膜溶解中的作用，不能归因于分子中的特殊基团，而是由于其自身在溶液中的物理化学性质。对于抗黏附作用，这被认为是在病菌和基底之间，糖和蛋白质的相互竞争作用导致的，其中蛋白质指碳水化合物结合蛋白，如细胞包膜中存在的凝集素和粘附素。通过调整碳水化合物涂层的性质（种类，流动性，糖的数量），可以增加或降低细胞对基底的亲和力，从而导致细胞黏附现象的增强和减弱。

在碳水化合物驱动的抗菌活性方面，我们在这里展示了上面第一个例子，具有生物杀灭特性的糖基化表面。为此，我们使用bola型糖脂家族的槐糖脂，其特征为一个槐糖单元通过糖苷键与一个油酸连接，在碳水化合物对面有一个游离的羧酸基团可用于化学接枝。槐糖脂具有低毒、高生物降解能性和环境相容性等特征，及在溶液中拥有抗真菌和/抗微生物的特性。槐糖脂是由球拟假丝酵母（Starmella bombicola）大量生产，且在全球已经商业化(例如, Soliance, Ecover, IntoBio, Saraya等)，且最令人感兴趣的是，其是现成的，不需要特别的化学合成，也不需要复杂的保护/脱保护修饰。和竞争对象抗菌肽及定制的糖结合物相比，它们是大规模抗菌表面应用的理想平台。此外，对于溶液中杀菌性能方面存在很大争议的槐脂，我们的方法证实了碳水化合物直接参与细胞膜的失稳/破环以及更一般情况下碳水化合物/膜脂的相互作用.以短硫醇胺为引物，可以将槐糖脂的开放酸性端接枝在金平板表面。用偏振调制反射吸收红外光谱(PM-RAIRS)和X射线光电子能谱(XPS)对改性后的金表面进行了逐步表征。抗菌活性是通过一种革兰氏阳性菌Listeria ivanovii来测试的，其被一层厚的肽聚糖层包围，没有外膜，因为槐脂在溶液中对出表现出这样细胞包膜的细菌更有效。通过原子力显微镜和具有场发射电子枪的扫描电子显微镜、荧光染色法、细菌生长测试等方法的联合应用，以及在单独金表面和半胱胺修饰的金表面作为空白对照下，来定性定量地评估其抗菌性能。为了阐述槐糖基团在杀菌性能方面的作用，我们控制改变接枝在金表面的三个与槐糖脂相关的基团，使其要么有相同的糖连有不同的链，要么只有链没有糖：（1）油酸组（OA），来模拟槐脂的脂肪链；（2）带有饱和脂肪链的槐糖脂衍生物（SL0），主要用来观察碳碳双键存在对金表面分子构象改变可能有的作用；（3）硬脂酸组(SA)，来模拟完全饱和槐脂衍生物的脂肪链。

材料和方法：半胱胺（cys）、N-羟基丁二酰亚胺(NHS)、1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰(EDC)、油酸（OA）、硬脂酸（SA）、甲醛、二甲亚砜和Sigma-Aldrich公司的氯化钠。槐糖脂是购买自Soliance公司的商业化酸和内酯混合型槐脂(Sopholiance S; batch number, 11103A; drycontent, 60 plusmn; 6%)。为了获得高层纯度(gt;sim; 92 mol %, by H-NMR)的非乙酰化酸性槐糖脂，我们使用了经典的水解路线，先加入5mol/L的氢氧化钠，然后盐酸酸化，然后用戊醇提取高纯槐糖脂（详情请参阅参考文献33）。完全饱和槐糖脂通过前体在34参考文献中描述的pb催化加氢反应下制得。所有溶剂都是试剂级别的，可以直接使用而不用进一步提纯。水是用EMD Millipore公司(Billerica, MA)的a Milli-Q 系统纯化得到的，玻璃基板购自Arrandee (Werther, Germany)，上面连续涂有50埃厚的铬，以及200nm厚的金。

表面处理。基板是按标准制备的。使用前，金涂层基板要在丁烷火焰中退火，以确保表层有良好的结晶度，之后在紫外-臭氧下暴露15min，用超纯水连续冲洗，之后用无水乙醇浸泡10分钟。首先，将基板浸泡在10mmol/L的Cys乙醇溶液中。3h后，在超纯乙醇中对基板进行超声处理，使未接枝的分子解吸，超声后用乙醇对基板彻底冲洗，乙醇冲洗后在超纯水中冲洗，冲洗后将基板置于在干燥的流动空气下吹干。然后，为了促进SL与硫醇-胺

接枝，在EDC（77mg/L）和NHS（23mg/L）的混合水溶液通过琥珀酰亚胺酯使SL(50mg

/L)的羧基端活化。搅拌一小时后，将cys修饰的金基板置于上诉溶液中浸泡3h。浸泡后用超纯水连续冲洗，用流动的干燥空气吹干前先在乙醇中除去非共价接枝反应物。用石英晶体微量天平来证实冲洗过程有效地清除了多余未反应的SL。OA、SA和SL0分别在乙醇中用相同的方法接枝到金表面。获得的表面如图一所示。所有样本在每一步功能化后都要用PM-RAIRS和XPS进行表征。

表征技术。偏振调制反射吸收红外光谱(PM-RAIRS)。PM-RAIRS通过使用配备有氮气冷却HgCdTe宽带检测器的NicoletNexus5700FT-IR光谱仪来执行测量。通过共加128次扫描，在8cm-1的分辨率下记录了红外光谱。在样品之前放置了ZnSe栅偏振器和ZnSe光弹性调制器，以调节p和s极化之间的入射光束(HINDS仪器,PM90, 调制频率= 36 kHz)。对和差干涉图进行傅里叶变换，得到PM-RAIRS信号，既差分反射率（Delta;R/R0）=(Rp-Rs)/(Rp Rs),其中Rp是与入射平面平行的信号，Rs是与入射平面垂直的信号。在两种不同电压下测量，应用于调制器ZnSe晶体以优化灵敏度。

红外衰减全反射光谱(IR-ATR)。IR-ATR测量是用Nicolet5700FT-IR光谱仪记录的，该光谱仪配备了氮气冷却的MCT探测器。通过共加256次扫描，以空气背景作为参考，在8cm-1的分辨率下测得红外光谱。

原子力显微成像(AFM)。使用Bruker仪器公司的AFM显微镜记录干燥表面的AFM图像。在轻敲模式下拍摄图片。应用了Silicon nitride tips（共振频率280-400Hz，力常数40-80N/m）。以1Hz的频率拍摄512*512分辨率的图像。利用Bruker的成像处理软件Nanoscope Analysis v.1.30对原始数据进行处理(Nano Surfaces Corp. Santa Barbara, CA)，主要用于斜度修正。

带有场发射枪的扫描电子显微镜（SEM-FEG）。用日立SU-70场发射枪扫描电子显微镜记录SEM图像。将没有金属化的样品固定在带有碳胶带的氧化铝SEM支架上。用透镜内二次电子检测器(SE-Upper)对样品进行了表征。加速电压为1kV，工作距离在5mm左右。每个表面至少分析了五个不同的位置，以观察到至少100个单一细菌。

水接触角测量。在静置条件下(20°C，40%的相对湿度)测量水接触角，分析无柄水滴的滴形。使用配备CCD摄像机和图像分析处理器的KrussDSA100装置（德国），在样品表面滴上10mu;L milliQ水滴，在样品不同位置各分析四次，并对三个不同的样品分别进行三次测试。报道的数值是每种平面十二次测量的平均值。

平面上SL和SL0的分子图。槐糖脂SL和SL0分子是通过酰胺键与半光胺共价结合的，要测出分子键长，二面角及各原子手性。槐糖脂的IUPAC名称为：17-L-[( 2′-O-beta;-D-吡喃葡萄糖基-beta;-D-吡喃葡萄糖基) -O-]-十八烯酸-1′，4Prime;-内酯-6，6Prime;二乙酸酯。绘制结构是用Gaussview软件（2.1），而图像是用PyMOL分子图形系统（1.3）完成的。

抗菌活性。菌种及培养条件。使用非人类致病菌Listeria ivanovii Li 4pVS2来研究修饰表面的抗菌性能。除非另有说明，细菌要置于37℃，250rpm转速下，在脑心浸液肉汤（BHI）培养基中过夜培养。然后将10000g肉汤离心5min，消除上清液，用等渗无菌溶液（NaCl0.9%）重新分散细菌。将肉汤的光密度控制在620nm波长下下吸收度为0.05，此时，对应5*10^6CFU。

细菌在样品上的沉积。首先用70%的乙醇水溶液清洗样品表面，置于无菌环境下干燥，然后在每个样品表面上滴100mu;L新鲜的细菌溶液。除非另有说明，在所有实验中，接种要在室温，潮湿环境下培养3h。

红外光谱法评价细菌粘附性。细菌培养沉积3h后，将表面用100mu;L无菌等渗溶液（NaCl0.9%）冲洗4次，并置于流动空气中干燥。为了扫描整个平面以收集所有附着细菌的信号，每个样品总共要通过PM-RAIRS获得10个红外光谱。所有的测量（裸金和修饰平面）在同一实验期间进行，从而减少因背景，光束强度校准变化而引起的干扰。通过考虑酰胺带区细菌红外指纹，来评估吸附细菌的相对数量。这个区域从1700到1500cm-1，包括由酰胺Ⅰ和Ⅱ贡献的吸收信号，分别为1660和1550cm-1。附着在不同表面的细菌用与金基底的比值百分比来表示：（样品酰胺吸收区域面积）/（金酰胺吸收区域面积）*100。这个百分比的不确定性来自于在所有酰胺区域测量的不确定性的传递。测量结果通过对三个不同样本重复测量来证实。

显微镜观察细菌形态。细胞形态的定性分析是通过AFM和SEM-FEG显微镜来实现的，其可使抗菌产品对细菌的作用可视化且可帮助辨别一般的目标点。因为SEM-FEG观察是在真空中进行的，所以样品须进行以下前处理：细菌培养期过后，加入12mu;L37%的甲醛溶液，用来固定细菌及防止细菌在干燥时破裂。15min后，用100mu;L的过滤超纯水洗去未吸附细菌，连续六次，并置于层流空气中干燥。

荧光染色法评估细菌活力，使用活菌/死菌活力试剂盒(BacLight)对表面受损细菌进行计数。总共，每1ml超纯水中加入Syto9和碘化丙啶(PI)等荧光染料各1.5mu;L，细菌培养后，用100mu;L无菌等渗溶液冲洗表面5次，并滴10mu;L荧光助色团溶液与表面上在进行显微观察前，将样品在室温下置于暗处10min。表面在整个实验时都要处于潮湿环境以防水分蒸发。将样品放于荧光显微镜下观察(AXIO 100 Zeiss)。用CCD相机(AxioCam MRmZeiss)在10倍或40倍物镜下拍摄图像。分别在455-495nm和505-555nm处激发和检测荧光（对Syto9），对于PI则分别在533-558nm和570-640nm处激发和检测荧光。对每个表面的大约10个不同位置进行了分析，得到数据后以便统计。对三组样品进行实验，且至少要计数1000枚细菌。使用软件ImageJ来进行细菌计数（红色，损伤胞膜；绿色，完整胞膜），活力计算如下：活力（%）=100*（绿色细菌数量）/（绿色细菌数

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