中国鲟鱼软骨中硫酸软骨素的提取纯化和表征外文翻译资料

 2022-11-08 18:51:00

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中国鲟鱼软骨中硫酸软骨素的提取纯化和表征

Ting Zhaoa, Ye Zhoub, Guanghua Maoa, Ye Zoua, Jiangli Zhaoa, Shiqi Baib,Liuqing Yangc* and Xiangyang Wud*

摘要

背景：中国鲟鱼（Acipenser sinensis）是中国重要的渔业资源。为了拯救这个物种过度捕捞，污染和污染，人造繁殖近年来发展迅速。 然而，含有大量硫酸软骨素（CS）的中国鲟鱼软骨在消费后被当作固体废物丢弃。本研究的目的是调查中国鲟鱼软骨中硫酸软骨素的提取，纯化和表征。

结果：最佳提取参数为NaOH水溶液与软骨粉末的比例为9.2，NaOH水溶液浓度为4.4％，萃取时间为3.9 h。在这些最佳条件下，中国鲟鱼软骨粗制品的产量为26.51％，符合模型预测（26.54％）。通过DEAE-52纤维素和Sephadex G-100柱色谱法纯化得到单一级分CS-11。其表征表明CS-11与多糖主链结构-4GlcAbeta;-3GalNbeta;一致，呈硫酸软骨素硫酸软骨素-6-硫酸酯的形式存在。

结论：本研究结果为促进中国鲟鱼资源利用提供依据，对于中国鲟鱼软骨在食品工业中的开发利用具有重要意义。

关键词：鲟鱼； 硫酸软骨素；萃取； 纯化；表征

介绍

中华鲟（Acipenser sinensis）是中国古老的一种古老的移栖物种，常被称为“生物化石”。主要生活在长江，但由于过度发育，流血，污染。为了挽救这种物种，自1983年以来就尝试了人工繁殖，近年来发展迅速。中国鲟鱼是一种以其鲜美的丰富营养而闻名的商业化生物。然而，含有大量硫酸软骨素（CS）但目前被淘汰为固体废物的中国鲟鱼软骨具有潜在的开发利用价值。因此，促进中国鲟鱼资源的利用是有意义的。

作为用于营养补充剂的商业产品的CS的已知来源是牛气管，猪耳和鼻和鲨鱼软骨的软骨环。其他可利用的来源，如鱿鱼和鸡骨龙骨。从软骨提取的CS已被广泛应用于药物，食品和化妆品.SCS通常用于治疗神经痛，关节炎和耳鸣以及加速溃疡咳嗽和预防高脂血症。对CS的生理功能和生物化学特征的进一步研究表明，它具有抑制血液凝固的作用，防止静脉硬化。

响应面方法（RSM）是统计学和数学技术的集合，可用于开发，改进和优化流程和产品。泛用于优化用于提取花青素，种多糖和蛋白质。然而，据我们所知，中国鲟鱼软骨提取CS没有系统的调查。。为了从制药，食品和化妆品行业的中国鲟鱼软骨中充分开发利用CS，本研究旨在优化粗CS的提取过程，调查其纯化和表征纯化的CS。

材料和方法

中国鲟鱼是从连珠渔业科技示范园（中国江苏镇江新区，2009年11月收集的）获得的，储存在-18℃。研究中使用的商业酶，即酸性蛋白酶（BR CY1010510），中性蛋白酶 （BR CY1010511），碱性蛋白酶（BR CY10626），胰酶素（BR 64006737），胃蛋白酶（BR 64007137）和木瓜蛋白酶（BR 64006882）购自Hemei Biology Co.，Ltd（Jingning，Shandong，China）。 所有溶剂和化学品均为分析纯，得自国药化学试剂有限公司（中国上海市）。

从中华鲟制备软骨

中国鲟鱼用自来水解冻消除肉体和内脏，在80℃加热约15分钟，去除肌肉和结缔组织，并用自来水清洗。然后将头骨部分的软骨在室温下空气干燥，并通过300目筛网压碎成平均粒度的颗粒。将获得的软骨粉末在室温下储存在干燥器中。

中国鲟鱼软骨近似分析

采用官方分析化学家协会（AOAC）推荐的方法，确定中华鲟软骨粗蛋白，水分，总灰分和粗脂肪水平。通过凯氏定氮法测定氮含量，然后通过乘以6.25的转换因子转化为粗蛋白质含量。通过在105和550℃的烘箱中加热来测定水分和总灰分含量，直到重量变得恒定。粗脂肪含量通过使用石油醚（沸点范围60-90℃）作为萃取剂在Soxhlet装置中全部抽提10g软骨来测定。

从软骨中提取粗制CS

干燥软骨粉末用石油醚脱脂，在40℃连续搅拌下用NaOH水溶液萃取。收集萃取液，室温下以4000times;g离心15分钟以除去残留物。在最适pH和温度下，用一定量的酶将上清液水解。酶解通过在85℃加热20分钟终止。将溶液离心。 将上清液用950mL L-1度为800mL L-1，并在4℃下保存24小时。将溶液离心，将沉淀物冻干以获得粗的CS。

筛选蛋白酶

用酸性蛋白酶，中性蛋白酶，碱性蛋白酶，胰酶，胃蛋白酶和木瓜蛋白酶分别水解用NaOH水溶液得到的提取物。将温度和pH条件调整到适当的范围内。通过Bradford的方法，采用牛血清白蛋白（BSA）作为标准，测定粗制CS的蛋白质含量。

自变量

表1.自变量及其水平使用Box-Behnken设计

X1：NAOH与软骨粉末的比例（v / w）

X2：NAOH水溶液浓度（％）

X3：提取时间（h）

级别

组

表2.在Design-Expert 7.0中运行实验设计及相应的结果

实验设计与统计分析

提取参数通过RSM使用Box-Behnken设计（BBD）进行优化。表1中给出的三个独立变量的范围和中心点值基于初步实验结果。BBD包括12个阶乘点和五个中心点的复制（表2）。将NaOH水溶液与软骨粉（X1）的比例，NaOH浓度（X2）和萃取时间（X3）作为独立变量。选择粗制CS（Y）的产量作为表2中给出的独立变量组合的响应。实验运行被随机化以最小化观察到的反应中意想不到的变异性的影响。 每次试验的响应值是三次测定的平均值。

基于实验数据，进行回归分析，并结合经验二阶多项式模型：

其中Y是响应变量，A0，Ai，Aii和Aij分别是截距，线性，二次和交互项的变量的回归系数，Xi和Xj是自变量（i？= j）。使用软件Design-Expert 7.0 Trial（State-Ease，Inc.，Minneapolis MN，USA）对二阶多项式模型的系数和从每组实验设计获得的响应进行多次非线性回归。表达了多项式模型方程的适应性。

合计

纯错误

缺乏适应性性

剩余的

模型

P值

F值

平方和

资源

表3. 回归模型和各自模型项的方差分析

作为表面和轮廓图，以便可视化每个因子的响应和实验水平之间的关系，并推导出最优条件。生成方差分析（ANOVA）表（表3）。所有术语在多项式中的意义通过F检验以概率（P）为0.05进行统计学判断。然后将回归系数用于统计计算，以从回归模型中生成尺寸和轮廓图

粗品CS的纯化

根据Wu等人，通过DEAE 52-纤维素柱和Sephadex G-100柱分离粗产物CS并依次纯化。轻微修改。首先，将200mg粗CS溶解在50mmol L-1乙酸钠（pH5.5）中，并加到已经用相同缓冲液预平衡的DEAE 52-纤维素柱（1.6cmtimes;50cm）上。柱逐步洗脱加入含有0-2mol L-1 NaCl的50mmol L-1乙酸钠（pH5.5），流速为1mL / min。根据通过咔唑法定量的总碳水化合物含量合并级分。获得CS的两个主要成分。然后将两个级分中和，浓缩，透析并在Sephadex G-100柱（1.6cmtimes;50cm）上进一步纯化，分别编码为CS-11和CS-22。中国鲟鱼软骨CS-11和CS-22的产量分别为10.86和1.69％。采用咔唑法对中国鲟鱼软骨进行定量分析，得出CS-11为2.88％，CS-22为0.41％。最后，由于CS-22产量低，只有纯化的CS-11被冻干才能进一步研究。

测量CS-11的分子量

在装有LC-10A色谱仪（Shimadzu），RID-10A折射率检测器，TSK的LC-10ATvp色谱仪（Shimadzu，Tokyo，Japan）上，通过高性能液相色谱（HPLC）测定CS-11的分子量 PWH保护柱（7.5mm idtimes;75mm; Tosoh Corporation，Tokyo，Japan）和TSK-GEL G4000PW柱（7.5mm idtimes;300mm; Tosoh Corporation）。 标准葡聚糖T-10，T-40，T-70，T-500和T-2000用作分子量标记。柱温保持在30℃。流动相为0.003mol L-1乙酸钠溶液，流速为0.8mL / min，注射体积为10mu;L。

化学成分的测定

通过气相色谱（GC）测定单糖组成。首先，将CS-11（1mg）和干燥的乙酸钡（5mg）放入安瓿中，然后将CS-11在密封管中用1mol L-1 HCl /甲醇溶液（1mL）甲醇溶解80℃20小时。过滤甲醇溶液，真空干燥。用1mL吡啶，0.4mL六甲基硅烷和0.2mL三甲基氯硅烷在室温下进行衍生化30分钟。反应用氯仿萃取（3times;1mL）。通过GC在装备有HP-1MS柱（30mtimes;0.32mm）的Shimadzu 2010色谱仪和火焰离子化检测器上通过GC分析衍生物，并且程序将温度从140℃升至160℃，速度为2℃ -1，然后以5℃min-1的速率升至260℃，以N2作为载气。 通过相同的程序测量标准单糖

核磁共振和红外光谱

使用溴化钾（KBr）颗粒法用NEXUS 670 FTIR分光光度计（Thermo Nicolet，USA）记录傅里叶变换红外（FTIR）光谱，以鉴定CS-11的类型。 将干燥样品（2mg）与KBr粉末（100-200mg）混合，并使用液压机压制成薄盘。 在4000-500cm-1的中红外区域获得光谱。 通过将样品悬浮在D2O中并冻干三次，将可交换的质子替换为氘。 一个使用Bruker DRX-400光谱仪（Bruker，Rheinstetten，德国）在5mm管中表征20mg CS-11样品，在30℃下对C 13 C核磁共振（NMR）的工作频率为100MHz。

结果与讨论

中华鲟软骨组成分析

根据AOAC方法对中国鲟鱼软骨进行近似成分分析。其水分，总灰分，粗脂肪和粗蛋白含量分别为111.9,56.8,96.8和522.0 g kg-1。这些结果表明，软骨灰分含量低，蛋白质含量高。下一步是从软骨中去除蛋白质。

蛋白酶对脱蛋白的影响

图1A显示不同蛋白酶对来自粗制CS的残留蛋白质的去除的影响。 本研究采用几种常见的蛋白酶。与其他蛋白酶相比，胃蛋白酶表现出优异的活性，因此最适用于清除蛋白质。 残留的蛋白质可以以蛋白聚糖的形式存在。

NaOH水溶液与软骨粉的比例对提取率的影响

不同比例NaOH水溶液对软骨粉末对粗品CS提取率的影响如图1所示。 1B。这些萃取液的NaOH水溶液浓度固定在5％，提取时间固定在4 h。原油CS的提取率从22.27％显着上升，比例为4时为26.5％，然后由于所需驱动力的增加而保持几乎恒定。 原油CS.19的传质越多，使用的水越多，乙醇被用于沉淀粗CS。 因此，NaOH水溶液与软骨粉末的比例为6-10是提取最有利的。

NAOH水溶液与软骨粉末的比例（v/w）

蛋白酶

蛋白kg-1

产量％

产量％

产量％

NaOH水溶液浓度（％） 提取时间（h）

图1.（A）不同蛋白酶对粗品CS蛋白质含量的影响：1，酸性蛋白酶; 2，中性蛋白酶; 3，碱性蛋白酶; 4，胰酶; 5，胃蛋白酶; 6，木瓜蛋白酶（B-D）（B）NaOH水溶液与软骨粉末比例的影响，（C）NaOH水溶液浓度和（D）提取时间对粗品CS产率的影响。 值为平均值plusmn;标准偏差（n = 3）。P lt;0.05（最不显着差异的方法），不同字母的含义显着不同。

NaOH水溶液浓度对提取率的影响

不同浓度的NaOH水溶液对粗品CS提取率的影响如图1所示。1C 这些提取采用NaOH水溶液与软骨粉末固定比例为8，提取时间固定在4 h。随着NaOH水溶液的浓度从1

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