毛细管高效液相色谱法与质谱法联合测定金银花中总黄酮、环烯醚萜苷糖甙、皂苷的含量外文翻译资料

 2023-01-31 11:04:57

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毛细管高效液相色谱法与质谱法联合测定金银花中总黄酮、环烯醚萜苷糖甙、皂苷的含量

摘要

传统中药金银花, 在中国已被用于治疗某些炎症性疾病。 几种不同类型的化合物从金银花中分离出来被用来评估其药理活性。 这些黄酮类、环烯醚萜苷和皂苷已得到充分的研究,并可能发挥它们的临床应用。 因此,金银花的质量控制对于药品安全性和有效性评估具有重要意义。用遵循毛细管高效液相色谱-二极管阵列光谱检测/电喷雾离子化质谱(capillary HPLC-DAD/ESI-MS)联用技术的固相萃取定量法，来同时测定金银花中24种化合物。在充分利用capillary HPLC-DAD/ESI-MS的条件下，九类黄酮、八类环烯醚萜糖苷和七类皂苷在选择离子监测(SIM)模式下被高效的分离出来。相关系数在0.9935–0.9998范围内有良好的线性关系，并且比2.57ng/mL的大多数其他化合物检测限低。加样回收率在91.0%~108.7%之间，RSD=8.74%(n=3)。capillary HPLC-DAD/ESI-MS成功地应用于五种金银花的分析。由于其专属选择性和出色的灵敏度，它被证明是一个中草药的综合分析的强大工具。

关键词：毛细管高效液相色谱-二极管阵列光谱检测/电喷雾离子化质谱(HPLC-DAD/ESI-MS)联用技术；金银花；定量分析；黄酮类；环烯醚萜苷类；皂苷

  1. 简介

在中国，传统中草药被广泛地应用于缓解和治疗很多不同人类疾病。因此，控制中药及其制剂的质量，保证用药的安全有效，显得格外重要[1]。然而，中草药由于其化学成分多而复杂使得化学分析并不简单[2]。中药成分复杂的混合物通常具有不同的物理化学性质,如可溶性和紫外吸收。另一方面，这些成分是一系列具有相同前体的类似物，它们不容易通过普通方法分离出来。此外，有一些生物活性成分只存在于数量很少的植物体中,并且他们的纯化和浓缩非常困难。因此，先进的现代分析技术被用来鉴定中药材的成分。薄层色谱法（TLC）、气相色谱法（GC）、高效液相色谱法（HPLC）和毛细管电泳法（CE）是分析中药材强有力的工具。基于这几种色谱法，高效液相色谱联合紫外检测、蒸发光散射检测（ELSD）以及质谱（MS）的技术是定性定量分析中药材使用的最广泛地技术。HPLC-MS联合了HPLC高效的分离能力和MS强大的结构表征能力。此外，在SIM模式下使用MS具有高选择性，同时与UV和ELSD相比也提高了灵敏度。在选定的色谱条件下，通过同样的试验要完全分离中药材中所有的成分是不可能的，特别是当这些化合物有相似的保留特征时。HPLC-MS具有比HPLC-UV或HPLC-ELSD对化合物更明确的鉴别和更精确的定量测定[14]。近年来，毛细管高效液相色谱法在很多研究领域中的应用越来越广泛[15–17]。毛细管高效液相色谱法比传统的HPLC法有很大的优势。首先，流动相特别是有机溶剂的消耗得以保存并且对环境的污染降低了[18]。其次，少量的分析物是必须的。重要的是，使用毛细管高效液相色谱增加了分离的效率和检测的灵敏度[19]。微升级流量是用于耦合毛细管HPLC系统与MS电离的良好效率无分离器的良好的条件[20]。到目前为止很少有报道关于通过毛细管HPLC-MS的方法分析中药材成分。

金银花是许多中国规定的处方中广泛使用的中药材之一，属于忍冬属（忍冬科）的几个物种的干花蕾。它用于痈肿，疔疮，丹毒，急性菌痢，咽炎，上呼吸道感染的治疗以及温病学的临床应用。在中国药典（2005年版），忍冬科植物作为最广泛和传统上使用的物种，被记录是因为Flos Lonicerae Japonicae（中国金银花）的独特的起源[21]。并且其他三个品种的忍冬属包括L. macranthoides Hand.-Mazz，L. hypoglauca Miq.以及L. confusa DC.被首次记录是因为Flos Lonicerae（中国山银花）的起源[21]，这通常是被替代为它们产地的金银花。除以上所述的物种外，一些当地的忍冬科物种例如L. fulvotomentosa, L. dasystyla和L. similes普遍被用在中国的一些研究领域。由于它们的起源的复杂性，这是评价金银花的不同来源和控制他们的质量的安全性和有效性的一个重要问题。在之前的许多研究中，金银花的质量控制通常是测定绿原酸，因为绿原酸是金银花的主要成分并且具有抗生素的性质。如今，金银花中黄酮类化合物[22,23]、环烯醚萜苷[24]和皂苷[12]已经被报道是重要的活性化合物。许多研究已经通过TLC、HPLC和CE用于分析金银花中的黄酮[25-27]、环烯醚萜苷[28,29]和皂苷[12]。就我们所知，目前尚未报道在同一步骤下同时确定三种化学类别的化合物的方法。由于传统的中药材及制剂中含有多种产生疗效的成分，而只研究一类化合物的质量控制是不理性的。在本研究中，我们发表了一种同时分离和定量测定24个化合物（包括9类黄酮，8种环烯醚萜苷和7种皂苷）的较高灵敏度和特异性的毛细管HPLC-DAD/ ESI-MS方法。

  1. 试验

2.1化学药品及试剂

参考化合物，包括（I）类黄酮：金丝桃苷（F1），槲皮素-3-O-葡萄糖苷（F2），芦丁（F3），木犀草素-7-O-葡萄糖苷（F4），忍冬苷（F5），麦黄酮-7-O葡萄糖苷（F6），麦黄酮-7-O-新橙皮（F7），槲皮素（F8）和木犀草素（F9）; （II）环烯醚萜苷：獐牙菜苷（I1），7-O-乙烷基獐牙菜苷（I 2），7-环氧氯丙烷基 - 断马钱子苷半缩醛内酯（I3），幼枝含断氧化马钱子甙（I4），幼枝含断氧化马钱子甙 -7-丁酯（I5），二裂环环烯醚萜苷（I6） ，centauroside（I7），马钱素（I8）; （Ⅲ）皂苷：常春配基-28-O- [beta;-D-吡喃葡糖基 - （1→6）-beta;-D-吡喃葡糖基〕酯（S1），3-O- [alpha;-L-吡喃鼠李糖 - （1→2 ） - alpha;-L-阿拉伯呋喃糖]常春配基（S2）中，3-O- [beta;-D-吡喃葡糖基 - （1→3） - alpha;-L-rhamnopyr-anosyl-（1→2） - alpha;-L-阿拉伯呋喃糖基]常春配基（S3），3-O- [beta;-D-吡喃葡糖基 - （1→4） - beta;-D-吡喃葡萄糖基 - （1→3） - alpha;-L-吡喃鼠李糖 - （1→2） - alpha;-L-阿拉伯糖]常春配基（S4），3-O- [alpha;-L-吡喃鼠李糖 - （1→2） - alpha;-L-吡喃阿拉伯糖]常春配基-28-O- [beta;-D-吡喃葡糖基 - （1→6） - beta; -D-吡喃葡萄糖]酯（S5）中，3-O- [beta;-D-吡喃葡糖基 - （1→3） - alpha;-L-吡喃鼠李糖 - （1→2）-alpha;-L-吡喃阿拉伯糖]常春藤-配基-28 -O- [beta;-D-吡喃葡糖基 - （1→6） - beta;-D-吡喃葡糖]酯（S6），3-O- [beta;-D-吡喃葡萄糖基 - （1→4） - beta;-D- glucop- yranosyl-（1→3）-alpha;-L-吡喃鼠李糖 - （1→2） - alpha;-L-吡喃阿拉伯糖]常春配基-28-O- [beta;-D-吡喃葡糖基 - （1→6） - beta;-D-吡喃葡糖]酯（S7），与我们实验室的几个种类的金银花隔离，包括L. japonica、 L. confusa 和 L. macranthoides [30]。它们的结构经光谱方法（UV，IR，MS，1H和13C NMR）被阐明，并且它们的结构式连同分子量（Mr）一起按照图1所示。内标物质（IS）人参皂苷R1是从中国药品生物制品检定所得到的。

HPLC流动相，乙腈是由默克公司（德国达姆施塔特）提供。分析纯醋酸由南京化工厂制得。去离子水从Milli-Q系统（Millipore公司，贝德福德，马萨诸塞州，美国）所得。 C18固相萃取（SPE）管（3米的L /500毫克）从Supelco公司（Bellefonte，PA，USA）购得。

2.2仪器

毛细管HPLC-DAD/ ESI-MS分析，在配备有二进制毛细泵，除气器，恒温控制自动进样器，恒温控制操纵室，二极管阵列检测器，50mu;L流通池和电喷雾电离（ESI）接口单四极杆质谱仪（SL G1946D）的Agilent 1100串联系统（德国·Waldbronn·Agilent公司）中得以实现。所有的操作中，数据的获取和分析由化学工作站软件（美国·Agilent科技，）处理。

2.3毛细管HPLC–DAD/ESI-MS色谱条件

在所有情况下，色谱柱为Zorbax SB C18柱（内径150times;0.3 mm，5mu;m，德国·Angilent科技），柱温30 ℃。流动相为含0.2％的醋酸（A），0.2％的乙腈（B）水溶液。梯度程序进行如下：0-12分钟，5-8％B; 12-21分钟，8-10％B; 21-36分钟，10-15％B; 36-46分钟，15-20％B; 46-50分钟，20-23％B;50-52分钟，23-28％B; 52-60分钟，28-29％B; 60-63分钟，29-34％；63-80分钟，34-54％; 流动相通过0.22mu;m的滤膜滤过。流速恒定为6mu;L/min，进样量：0.02 mu;L。检测波长在250~350nm之间。电离条件进行如下调整：干燥氮气，流量：8 L/min;干燥气体温度:300℃;喷雾气体（氮气）的压力：16Pa;毛细管电压:3500V; 四心线组温度:100℃;片段电压90V施加到黄酮类和环烯醚萜，210 V施加到皂苷。HPLC系统直接连接到质谱仪而无流拆分。HPLC-MS系统是在用于定量分析的SIM数据采集模式下的负电离模式下运行。一系列选定的m / z值通过使用时间程序的SIM模式，根据保留时间和从毛细管HPLC-MS通过扫描在250-1400 m/z的范围内得到的各峰的特征离子的数据监测。

2.4材料和样品制备

五种金银花样品：L. japonica，L. micranthemoides，L. fulvotomentosa Hsu et S.C. Cheng ，L. confusa ，L. hypoglauca Miq.分别在中国河南封丘，重庆、贵州安龙、湖南溆浦和江西九江采集。植物是由Ping Li教授验证，凭证标本保存在中国药科大学药学院。

0.5g金银花干燥粉末与50 mL石油醚脱脂1小时，然后用50mL甲醇回流4小时。取2mL滤液加入100 mu;L内标溶液，然后用水稀释至20毫升。至于一些分析物，样品中浓度已经超过了线性范围的上限，取50mu;L滤液进行分析。将所得溶液装入预先用5.0mL甲醇和5.0mL水处理的一个Supelco SPE管中。用3times;1.0mL水洗涤之后，在空气中干燥15分钟。然后加入1.0mL70％的乙腈，并在该洗涤步骤中回收。洗脱液用0.22mu;m的滤膜滤过，既得。待用于毛细管HPLC-DAD/ ESI-MS分析。

2.5方法学验证

进行了一系列的样品分析：线性关系，精确度，专属性，限制检出限（LOD）和定量限（LOQ）来验证方法的性能。制备含9种黄酮（F1-F9），8种环烯醚萜苷（I1-I8）和7种皂苷（S1-S7）的标准储备溶液，并用70％乙腈稀释至适当浓度用于校准曲线的构建。内标物人参皂苷R1的浓度为 13.6 mu;g/mL。校准曲线通过绘制与相应浓度的标准溶液的相对峰面积（Ar）构成。Ar被定义为相应的标准物的峰面积与内标物的峰面积的比。精密度是通过计算在三个重复日内和日间中间浓度的变化进行评估。保留时间（t R）和Ar的相对标准偏差（RSD）表明精密度。LOD和LOQ通过基线噪声装置估算，信噪比（S / N）分别为3和10。回收率试验用来评价方法的专属性。L. macranthoides因可检测到大多数分析物而被选定其做回收率试验。在 L. macranthoides 的SPE处理之前将已知含量的样品加入到样品标准溶液中。然后，对供试品与对照品进行分析。平均回收率和重复性试验在三个实验的补充标准计算。

3．结果与讨论

3.1毛细管高效液相色谱条件的优化和ESI / MS的分析标准

乙腈，考虑到其对黄酮苷有更好的溶解性的和其较低的粘度，以降低系统的压力被用作流动相。一般情况下，非挥发性盐和离子性试剂都要避免作为HPLC-MS系统的流动相，因为它们对目标化合物离子源造成污染和抑制离子化[31]。所以挥发性酸如乙酸用于改善色谱条件并减少峰拖尾。虽然它在同时分离分析24化合物是一个挑战，但是我们成功地通过改变流动相的组成和不同的溶剂浓度梯度来改善色谱选择性。乙腈和含有不同浓度的乙酸的混合水溶液在30◦C下以6mu;L/min流速进量。其最佳色谱条件以在2.3节中描述。

由于不同的pi;共轭扩展，环烯醚萜苷显示出最大吸收波长在240-260 nm，而黄酮我们研究显示在240-270 nm处有最大吸收峰，

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