将4-氟组氨酸遗传掺入多肽中可实现多肽选择性亲和纯化外文翻译资料

 2021-12-25 16:57:06

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将4-氟组氨酸遗传掺入多肽中可实现多肽选择性亲和纯化

Christine M.Ring,Emil S.Iqbal,David E.Hacker,MatthewC.T.Hartman,and T.Ashton Cropp

引言 因为4-氟组氨酸的酸度系数相对于组氨酸降低了,所以含有这种氨基酸的多肽和蛋白质可能具有新的性质。本文报道了4-氟组氨酸的优化合成方法，并表明其能有效替代组氨酸在体外翻译的反应。此外，含有6x-氟组氨酸标记的多肽能够在His标记的蛋白质混合物中从镍树脂中被选择性捕获和洗脱。

将非经典氨基酸与蛋白质结合能有效操作蛋白质的功能和结合。4-氟组氨酸就是一种非经典氨基酸。因为氟的范德华半径仅仅略大于氢的半径，所以氟组氨酸可以被认为是组氨酸的电子等排体。实际上氟组氨酸可以作为组氨酰-tRNA合成酶（HisRS）的底物，该酶已经被广泛利用于体内生产含有这类残基的蛋白质。Bann和他的同事通过使用营养缺陷型大肠杆菌，可以将2-和4-氟组氨酸引入到蛋白质中。这可以作为使用19F NMR工具研究蛋白质构象变化的方式。此外，氟组氨酸可以作为机械探针，因为虽然分子的大小没有大幅度改变，但两个系统（氟组氨酸与组氨酸）的电子学效应发生了改变。引进电负性氟将pKa从组氨酸的6降低到4-氟组氨酸的2。这种降低情况可以用于阐明组氨酸在蛋白质中的作用或在可变PH下操纵蛋白质功能，如我们在此所示在降低PH是可以选择性亲和富集。

Hexa-histidine标记是蛋白质净化最普遍的方法之一。用小尺寸Hexa-histidine标记，与镍树脂的高亲和力提高，降低成本，以及能使用容易再生的树脂，捕获具有组氨酸标记的重组蛋白质是不错的方法。然而在某些情况下，当Hexa-histidine标记也有一个缺点。在使用重组元素方法（PURE），大肠杆菌翻译蛋白质（延伸，起始和终止因子，以及氨酰是-tRNA合成酶）时通过Hexa-histidine表达和纯化。这些组分与必须的氨基酸，核糖体和mRN结合一起，合成物生物合成肽或蛋白质。然而该方式被广泛使用在体外蛋白质表达，但它也在探索非经典氨基酸翻译的实验中找到了一席之地（ncAA）。这些实验通常利用编码短、信号强标记肽的mRNA底物，并分别用S-甲硫氨酸掺入法和MALDI-TOF技术来分析产率和纯度。FLAG标记在现在存在三个困难：（1）抗标记亲和树脂的高较本，（2）标记肽对MALDI电离的乙酯作用较高，（3）标记（Asp/ASPRS、Try/TyrRS、Lys/LysRS）的三种氨基酸/氨基酰基tRNA合成酶（Asp/AspRS,Tyr,Lys/LysRS）。六聚组氨酸标记可以解决这三个问题中的每一个，但由于PURE蛋白质也是六组氨酸标记，对翻译后肽的进行Ni-NTA纯化，使PURE蛋白质与所需肽的需要同时纯化。这些PURE蛋白质会影响后面的实验，例如结合亲和力的测定。在这项工作中，我们通过使用4-FluoroHis标记来探索这个问题的潜在解决方案。

图 ES1

为了产生大量4-氟组氨酸用于蛋白质的生物合成，我们重新进行了综合研究，由Kirk及其同事提出。我们遇到了困难，但重现了报道中的中间体和最终化合物的产率。此外，原始方案中未报道某些中间体的全光谱表征，因此我们决定优化该程过程的每个步骤。由此产生的合成方案在方案1中示出。重要的是，我们观察到2至3转化早很大程度上可以实现，并且比最初报告使用的时间更少。我们使用溴化中间体6代替氯化类似物，结果使两步的产率提高7%。最后，我们选择在纯化前保先对化合物7进行保护，这些变化（在ES1中详述）让理论总产量从原料到第六步的产率为6%。产率虽然较低，但我们能够生产更大数量(gt;100mg)的化合物,用于蛋白质表达实验。

氟组氨酸是体外翻译的底物

在纯化4-FluoroHis的基础上，我们首次用基于MALDI的电荷分析方法验证Hf是野生大肠杆菌的HisRS的底物。它很容易接受Hf作为底物，从而产生带电荷的tRNA His（图1A和B）。接下来，我们尝试将Hf掺入由含有编码的六组氨酸标记的（MNHHHHHMVEP）的mRNA模板编码的肽中，通过将组氨酸排除在无细胞翻译的系统中，并用HF替换。我们惊喜地发现翻译系统能添加六个连续的HF残基（图1C和S1）。根据MALDI-TOF（图1C）测量，HF转化具有良好的保真度，并且通过S-甲硫氨酸掺入测量Hf具有的良好翻译保真度（图1D）。根据MALDI-TOF数据，我们观察到一个主要的峰对于一个完整的六氟组氨酸，以及一个小的次级峰对应与五个Hf残基肽和一个组氨酸。这种小污染可能是由PURE残留少量组氨酸引起的。

图1C

图1 4-氟组氨酸与体外翻译（A）MALDI-TOF酰胺基-tRNA合成酶测定（AARS）与HisRS相容，但没有添加4-FluoroHis。 （B）用HisRS和4-FluoroHis进行的MALDI-TOF AARS测定。M计算值911.2738，测定值911.2710。 （C）体外翻译反应在4-FluoroHis存在下编码肽MNMVEP的模板。主峰对应于六个氟组氨酸掺入：（M-M）-计算值1562.5394，测定值1561.8245，次要峰五个氟组氨酸和一个组氨酸—（M-M）-计算值1544.8708。 （D）含有100mu;M组氨酸或600mu;M 4-氟组氨酸的50mu;L翻译反应的pmols翻译产率。实验一式三份进行。误差线表示平均值的标准偏差。

图 1D

图2 （A）用各种pH缓冲液在Ni-NAT树脂上洗涤。用1%TAF洗脱肽，并通过35S-Met的闪烁计数定量。计数与pH=8时的实验有关。错误条代表重复一式三份进行的实验的标准偏差。 （B）PURE系统的捕获作为pH缓冲剂的函数His-标记的蛋白质与（A）中相同。使用1%TFA进行洗脱，并通过Bradford测定法定量每种pH下的蛋白质浓度。计数相对于pH=8的实验。 （C）Coommassie染色的SDS-PAGE凝胶显示HIs标记的PURE系统蛋白质的捕获作为pH的函数。

在带有his标记的蛋白质存在下选择性捕获FluoroHis标记的肽

基于其降低的pKa，我们预期Hf6标记的多肽类将在低pH下保持与Ni-NTA树脂的结合。为了测试这一点，我们在pH值为8.0和3.0之间，用10倍体积的结合缓冲液淬灭了体外翻译反应产物。淬灭产物与Ni-NTA树脂结合，用相同的pH的缓冲液洗涤三次，最后用1%TFA洗脱。在测试的最低pH（pH=3）时，得到五种不同大小的六氟组氨酸标记的肽保留在Ni-NTA树脂上。

在这些实验中使用的PURE翻译方法中，有30个单独的His标记蛋白质。我们使用Bradford测定法测量捕获和洗脱总His标记蛋白质，用相同的结合/洗涤pH范围。我们观察到，实际上大多数蛋白质在较低的pH值下易洗脱。在pH 3.0时，蛋白质浓度处于最低水平。SDS-PAGE分析显示相同的趋势。然而，有一种多肽在低PH下结合量有所增加，这可能是由于之前树脂结合位点的释放被蛋白质占据。最后，低PH捕获/洗脱方法不会导致肽降解。（图S2）。因此，在低PH下，六氟化标记多肽可以有选择地捕获存在Ni-NTA树脂上或洗脱树脂被标记的蛋白质。

结论

在这项工作中，我们已经证明4-氟组氨酸不仅是蛋白质生物合成的良好底物，而且可以在体外产生六中连续4-氟组氨酸肽。此外，该标记还可用于在许多其他histsgged蛋白质存在下选择性地富集多肽。在这里工作中，我们专注于短肽，我们利用放宽底物特异性的HisRS重新分配组氨酸密码子。如果应用于较大蛋白质的情况下，4-氟组氨酸的掺入可能仅限于那些不需要天然组氨酸残留物的蛋白质。最后，本文提出的修订4-氟组氨酸合成方法应该能够在其他生物化学实验中使用这种非天然氨基酸。

致谢

作者非常感谢国家科学基金会（CBET-1603930至TAC）和国家卫生研究院（RO1-CA166264至MCTH）的资助，以及StacieRichardson 博士对草案的有益评论。MALDI-TOF仪器是CCSG资助的MCC蛋白质组资源的一部分，NCI 5P30CA16059-35。

注释和参考

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      资料编号：[3672]

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