LPS全身性给药可引起脑炎症，但不会导致黑质多巴胺能神经元死亡外文翻译资料

 2021-10-24 14:21:01

英语原文共 10 页

LPS全身性给药可引起脑炎症，但不会导致黑质多巴胺能神经元死亡

概要

脑损伤的加重或炎症引起的脑炎症对包括帕金森病(PD)在内的神经退行性疾病的发展中起着重要的作用。最近贫血性炎症也已成为PD的危险因素。在本研究中，我们评估了静脉注射脂多糖(LPS)引起的全身炎症对大鼠脑炎症和神经元损伤的影响。有趣的是，几乎所有的脑炎反应，包括微胶质的形态学活化、中性粒细胞浸润和炎症介质的mRNA/蛋白表达。炎症介质的mRNA/蛋白表达在4~8h内出现，1~3天内在多巴胺能神经元所在的黑质(SN)中表达减弱。更重要的是，多多巴胺能神经元丧失是无法检测到的。这些结果表明，急性诱导全身炎症会引起脑炎症，但毒性不足以引起神经元损伤。

关键词：脑炎症；神经损害；神经损害；全身炎症

简介

帕金森(PD)是第二常见的神经退行性疾病，其特征是黑质致密部(SNPC)多巴胺能神经元的变性导致的运动障碍。然而，由于大多数(90%-95%)PD病例是不定时发生的，尚不清楚PD是如何发生和发展的。家族性帕金森病患者中发现编码alpha;-SyNucin、Parkin、Pink 1、DJ-1、LRRK 2和HTA 2的基因突变。然而，携带这些pd相关基因突变或敲除的动物很少出现pd样症状或多巴胺能神经元丢失。这些发现表明PD相关基因的异常功能不足以导致PD。因此，某些微环境因素，如脑炎症，被认为是导致和/或加重包括PD在内的神经退行性疾病的重要因素。在PD脑组织中，促炎细胞因子的表达水平高于对照组。小胶质细胞(脑巨噬细胞)在死后PD脑和许多PD的实验模型中被激活。非甾体抗炎药(NSAID)的使用降低了PD的发生率，尽管这一论点仍有争议。

脑损伤引起脑炎症。小胶质细胞是大脑中的主要炎症细胞，它不断地观察正常大脑的环境，并对损伤迅速作出反应，产生炎症介质。此外，血液中的炎症细胞被系统地给予LPS激活，可能进入大脑并参与炎症。然而，尚不清楚全身炎症是否会引起足够强烈的脑炎症，从而导致神经元损伤。用脂多糖和干扰素-gamma;刺激培养的小胶质细胞产生神经毒性炎症介质，包括诱导型一氧化氮合酶(INOS)，而脑损伤和LPS注射在体内激活的小胶质细胞合成的INOS很少，且无神经毒性。在本研究中，我们研究了全身性炎症如何影响脑炎症，以及这种炎症是否会引起神经元毒性。

结果

系统给予LPS后小胶质细胞和星形胶质细胞的行为。

为了研究全身炎症(SI)对大脑的影响，我们首先检测了全身注射LPS后小胶质细胞和星形胶质细胞的行为。我们将注意力集中在SN区，因为这一区域的炎症被认为是多巴胺能神经元变性的危险因素，导致PD的发生。如上文所述，当体重为230~250 g的大鼠静脉注射1 0 0和5 0 0mu;l PBS时，血浆中肿瘤坏死因子-alpha;水平在1h内急剧升高，3 h后迅速下降至基础水平。注射100和500mu;g LPS后，肿瘤坏死因子-alpha;(TNF-alpha;)水平无显着性差异，因此，我们在各种实验中使用了250或500mu;g LPS。在PBS处理的对照组动物中，离子化钙结合适配器分子1-免疫阳性(Iba-1)小胶质细胞呈分散的形态。多巴胺能神经元突起所在的网状黑质(Snr)的小胶质细胞密度高于先前报道的SNPC中的小胶质细胞密度。静脉注射LPS后8h，IBA-1小胶质细胞的突起稍短并增厚，这些特性在SNPC中比在Snr中更加突出。注射后24小时，形态学恢复正常。

同时观察大鼠脑内星形胶质细胞在SI诱导后的行为。SNPC的星形胶质细胞密度明显低于Snr。与研究小胶质细胞时不同的是，静脉注射LPS后，这两个区域的形态或星形胶质细胞数目均无明显变化。这些结果表明，全身性LPS快速注射(8h内)特别是小胶质细胞反应可引起脑炎症。

全身注射LPS后中性粒细胞浸润脑组织

中性粒细胞被招募到LPS注射的、创伤的和缺血性的脑中，炎症反应是神经毒性的。因此，我们检查了脑的中性粒细胞浸润模式下大脑对IV LPS注射的反应。为此，对脑切片进行了中性粒细胞标记物髓过氧化物酶(MPO)的染色。在神经中枢中，注射LPS后4小时内几乎检测不到MPO细胞(箭头)，8 h时数量增加，16-24小时下降。然而，与直接输注LPS相比，静脉注射LPS后脑内的中性粒细胞浸润较少。我们还研究了SN是否比其他脑区更能渗透到中性粒细胞中，并发现中性粒细胞在SN和皮质中的浸润程度相似。这些结果表明，在全身炎症过程中，SN并不特别容易发生中性粒细胞浸润。

全身注射LPS后炎症介质的表达

其次，在SN中，我们应用实时定量聚合酶链反应(Q-PCR)检测了白介素-1beta;(IL-1beta;，TNF-alpha;，IL-6)等促炎症介质在全身注射LPS的反应中mRNA的表达。所有检测到的mRNA水平在静脉注射LPS后4h内均升高，8h达到高峰，然后接近(或略大于)基础水平(Plt;0.01)。

免疫组化结果显示，ll-1beta;在lps注射后4h几乎未见表达，8~16h表达增加，24 h下降，3d后完全消失。我们还研究了iNOS的表达对一氧化氮生成的催化作用以及代表吞噬状态的分化簇68(CD 68)。与研究IL-1beta;表达时不同的是，只有少数细胞表达INOS和CD 68。有趣的是，IL-1beta;在Iba-1细胞中未检测到，而INOS和CD 68在Iba-1细胞中未检测到。这些结果表明全身炎症诱导了促炎症介质的瞬时表达，小胶质细胞和中性粒细胞合成了这类炎症介质的不同亚群。

LPS全身给药对多巴胺能神经元活力的影响

虽然iv LPS注射可引起脑炎症，但这种炎症与直接向脑内注射LPS相比，是短暂的、相对轻微的。因此，我们研究了全身炎症是否引起多巴胺能神经元损伤。在注射PBS的大鼠中，多巴胺能神经元不受影响。在注射LPS的大鼠中，在注射LPS后8d内无法检测到多巴胺能神经元的丢失。经体视学计数，注射PBS(15，100plusmn;1，754细胞，平均plusmn;SEM)或LPS(15，900plusmn;2，587细胞，平均plusmn;SEM)后，多巴胺能神经元数无明显差异。同时，这些结果表明，虽然急性全身性炎症确实会引起脑部炎症，但其作用是轻微的，不会引起神经元损伤。

讨论

这次研究表明了全身性炎症可能通过诱导脑炎症而影响包括PD和阿尔茨海默病在内的慢性脑疾病的发生和发展。本研究结果显示，静脉注射脂多糖确实会引起脑部炎症。小胶质细胞形态激活，中性粒细胞浸润脑，合成炎症介质，包括IL-1beta;、TNF-alpha;、IL-6、INOS和CD 68。然而，没有明显的神经元死亡。这些结果表明全身性炎症确实会引起脑部炎症，但程度很轻，不会导致神经元死亡。

中性粒细胞浸润的程度可显著影响损伤脑内神经元的死亡水平。中性粒细胞是包括INOS、环氧合酶-2、单核细胞趋化蛋白-1在内的促炎介质的主要来源，这些物质在LPS注射和/或缺血脑内神经元死亡中起重要作用。在此之前，我们发现直接注射LPS比直接注射到大脑皮层或海马区吸收的中性粒细胞更多，这表明这些区域对LPS神经毒性的易感性可能不同。LPS iv注射产生的中性粒细胞比直接注射LPS更少，并只引起炎症介质的短暂表达，持续时间长达1-3d。此前，有报道称，单次腹腔注射LPS可提高脑组织中TF-alpha;的mRNA和蛋白表达水平，持续时间超过10个月。虽然我们没有在这么晚的时间点分析炎症介质的表达水平，但是我们可能很难在炎症反应消退后再刺激它们，毋庸置疑，有一下几个原因。首先，在成年大鼠中每天更新约11次脑脊液，并维持大脑环境的稳态。其次，脑中性粒细胞是促炎介质的主要来源，在注射LPS后1-5天死亡，反映出对损伤的早期反应。第三，抑制细胞因子信号家族蛋白和抗氧化酶，解决炎症过程被激活，以防止长期炎症。因此，在没有新的触发装置的情况下，急性脑炎症可能不会持续数月。

有趣的是，虽然单纯培养中的小胶质细胞合成了大量的iNOS和TNF-alpha;，但是体内研究的小胶质细胞表达的包括INOS在内的神经毒性炎症介质(如果有的话)含量非常低。这种在体内和体外炎症反应的差异可能反映了星形胶质细胞的影响，星形胶质细胞抑制了小胶质细胞的活动。脱氢表雄酮和前列腺素是星形胶质细胞分泌的候选抗炎因子。DHEA能抑制TNF-alpha;诱导的核因子-kappaB(NF-kappa;B)的活化，而前列腺素E2则降低Akt的活化以及NF-kappa;B的核易位。注射脂多糖的动物脑内星形胶质细胞保持健康，并且会分泌抗炎因子抑制炎症介质的微胶质表达。此外，活化的小胶质细胞还产生神经营养因子，如转化生长因子-beta;1、神经营养因子-3和脑源性神经营养因子。此外，并不是所有在大脑中产生的炎症介质都是神经毒性的。例如，IL-1beta;对神经元活力的影响是有争议的；这种材料被认为是具有神经毒性的或是神经营养/神经保护作用的。

虽然全身性炎症并不会引起SNPC内多巴胺能神经元的损伤，我们不能排除全身炎症仍是神经退行性疾病发展的危险因素的可能性。全身炎症可将亚毒性的侮辱转化为毒性，和/或轻微的毒性。尽管帕金缺乏的小鼠没有表现出SNPC多巴胺能神经元的变性，低剂量LPS的长期全身治疗还是可以引起持续性神经炎症和多巴胺能神经元的选择性丢失。在小鼠朊蛋白病模型中，全身性LPS给药加重了神经元死亡的程度。为了支持这种可能性，据报道，长期使用非甾体抗炎药(这种药物很难穿透脂质膜)可以降低神经退行性疾病的发生风险。

总之，全身炎症本身可能不足以引起神经元死亡，即使在SN内也是如此。然而，我们不能排除这种炎症与其他侮辱相互作用以增强神经元损伤的可能性。因此，抑制全身炎症可能会降低脑部炎症的可能性，从而帮助保护神经损伤和神经退行性疾病的发展。

方法

LPS全身性给药

所有实验均按照经批准的动物规程和Ajou大学医学院动物实验伦理审查委员会制定的指南进行。雄性SD大鼠(体重230~250 g，7周龄)腹腔注射克他命(40-80 mg/kg)和甲苯噻嗪(5-10 mg/kg)进行麻醉。LPS(100~500mu;g，250mu;l无菌PBS；Sigma，St.Louis，MO)通过尾静脉注射。以PBS注射动物作为对照。

组织准备

大鼠麻醉后，用含0.5%(w/v)硝酸钠和肝素(10U/ml)的生理盐水经心脏灌注，在0.1M磷酸盐缓冲液(pH7.2)中加入4%(v/v)多聚甲醛，实现组织固定。取鼠脑，在4%(v/v)多聚甲醛作用下过夜固定。在4℃线下，将固定的大脑加入到30%（w/v）的蔗糖溶液中，直到大脑片段下沉。利用滑动微体获取了6个不同系列的冠状脑片，每片厚度为30mu;m。制备RNA时，麻醉大鼠，用无多聚甲醛的生理盐水经心脏灌注。用大鼠脑切片基质(1.0mm切片间隔；RBM-4000 C；ASI仪器，Warren，MI)和剃刀片对大鼠的大脑进行切片。选择包括针头注射点在内的切片，制备针尖下方的组织块(2times;2times;2mm3)，在-70℃保存至使用。

免疫组织化学

在3，3-二氨基联苯胺染色前，连续切片用PBS冲洗三次，用3%(v/v)H2O2处理5 min，用含0.2%(v/v)Triton X-100(PBST)的PBS冲洗。在PBST中加入1%(w/v)BSA可阻断非特异性结合。切片在室温下用抗iba-1(1：1，000；wako纯化学物质)，GAP(1：300；Sigma，St.Louis，MO)，MPO(1：1，000；DAKO，Glostrup，丹麦)，IL-1beta;(1：200；Ramp;D Systems，明尼阿波利斯，MN)，iNOS(1：200；ABCAM，剑桥，英国)，CD 68(1：200；Abd Serotec，牛津，英国)，或酪氨酸羟化酶(TH；1：2，000；Pel冻结生物制剂，Rogers，AR)的原抗体孵育2 h。用PBST冲洗后，切片与生物素化的二次抗体(载体实验室，Burlingame，CA)和亲和素/生物素系统(载体实验室)共同孵育，在0.1M PB中，用0.05%(w/v)民建联和0.003%(v/v)双氧水显示了亲和素/生物素系统(载体实验室)和条带化。接着，将切片安装在明胶涂层的幻灯片上，并在明亮的视野显微镜下进行检测(奥林巴斯光学公司bx 51，日本东京)。用PictureFrameApplication2.3软件存储亮场图像。免疫荧光染色：用1%(w/v)牛血清白蛋白(BSA)冲洗两次，与抗Iba-1、MPO、iNOS、白细胞介素-1beta;和CD 68抗体联合孵育。使用Alexa Fluor 488-或Alexa Fluor 555-共轭次级抗体(稀释1：600；Invitrogen，Eugene，OR)实现可视化。利用载体实验室(DAPI)对核素进行检测。在共焦显微镜下(德国耶拿，卡尔蔡司)用40times;水和63times;浸油目标在20℃下对切片进行分析，并利用Zeiss LSM 510共焦软件拍摄图像。(卡尔·蔡司，耶拿，德国)。

实时定量聚合酶链反应

根据制造商指示，总RNA是用一个简单的蓝色RNA提取试剂盒(内含子，Sungnam，韩国)和cDNA制备的逆转录母预混(ELPisbio，大田，韩国)。对于Q-PCR，使用KAPA SYBR快速qPCR试剂盒(KAPA生物系统，波士顿，MA)和Corbett转子-基因6000实时旋转分析仪(Corbett Research，Mortlake，澳大利亚新南威尔士州)。特异性引物扩增编码IL-1beta;、TNF-alpha;、IL-6和甘油醛-3-磷酸脱氢酶(Gapdh)的mRNAs，并用于q-pcr，详见补充数据表S1。Q-PCR条件为：95oC为30s，95oC为3s(熔融)，55oC为20s(退火)，7

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