pH控制的聚多巴胺纳米粒用于抗癌药物的给药外文翻译资料

 2022-01-18 22:35:23

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文献译文：

pH控制的聚多巴胺纳米粒用于抗癌药物的给药

Chia-Che Ho bull; Shinn-Jyh Ding

摘要：本课题拟采用一种新的方法制备聚多巴胺纳米粒子。考察多巴胺溶液初始pH值对聚多巴胺纳米粒子形成动力学、化学结构和生物相容性的影响。此外，我们还选择了一种新型的抗癌药物来评价聚多巴胺纳米粒子的载药效率和释药行为。结果表明，聚多巴胺纳米粒子的大小和产率与预光标溶液的pH值密切相关。当反应时间是6小时时，在初始pH分别为7.5、8、8.5和9的条件下，聚多巴胺纳米粒子的粒径分别是400、250、150、和75nm；产率分别是3%、7%、20%和34%，在pH分别为7.5、8、8.5和9的条件下，合成的1mg聚多巴胺纳米粒子的负载量分别是10.85, 11.81, 10.17, and 6.19micro;g，第一天后，由pH分别是7.5、8、8.5和9的聚多巴胺纳米粒子释放出19%、20%、25%和36%的纳米粒子，这取决于粒径的大小。结果表明，聚多巴胺纳米粒子具有良好的转归性：无明显转归，且不引起转归细胞的急性毒性。在聚多巴胺纳米粒子中的负载显著地降低了纳米颗粒和细胞的活性，这与游离的纳米粒子是相当的。结果表明，本方法制备的聚多巴胺纳米粒子是潜在的抗癌药物载体。

  1. 导言：多巴胺是一种重要的转氨酶递质，在中枢神经、肾和血管系统中起着重要的生理作用。多巴胺中临胺官能团和伯胺官能团的共存使得大量的功能分子能够连接到材料的表面。多巴胺可以自发的在温和的弱碱性（pH8.5）环境下形成类似于聚多巴胺的聚合物。用于制备聚多巴胺颗粒和薄膜的多种方法为后改性提供了平台，包括金属膜上沉积、自组装和接枝等。更重要的是，它的低纯度使得聚多巴胺成为潜在的医学药物载体。在合成聚多巴胺胶囊时，采用模板法，将聚多巴胺包裹在硬质（如二氧化硅颗粒）或者软芯（如乳化液）上进行原位组合，再用特殊溶剂除去核。可以通过控制核的大小来得到的粒径在100到500nm之间的聚多巴胺胶囊。化学物质，比如药物和量子点，可以再聚多巴胺胶囊中通过乳剂的变体，然后再涂上聚多巴胺图层和去核。聚多巴胺纳米颗粒对特定分子的吸收和释放性能优异。然而在使用复杂的模板法制备聚多巴胺纳米粒子应该考虑到以下几个问题。其中，使用苛刻的物质（不如酸和有机溶剂）除去固体后期的核心模板会限制生物分子的加入。另外利用乳化液制备空心粒子是另一个问题，虽然乳化液可以溶解在试剂中，但是由于处理过程复杂，很难获得较好的颗粒产物，为解决上述问题，需要一条合成纳米级聚多巴胺颗粒的用于药物递送的新途径。纳米颗粒的尺寸、形状和表面电荷等特性在改变细胞活性、细胞细胞活力和其它功能方面都起着至关重要的作用。pH值，多巴胺浓度、反应温度等试验参数都可以控制聚多巴胺纳米颗粒的粒径。建议在无颗粒模板的溶液中，通过多巴胺的自氧化和聚合作用制备聚多巴胺纳米粒子，此外。多巴胺溶液的pH值可能对控制聚多巴胺粒子特性有着重要意义。据我所知，对于多巴胺溶液的pH值对聚多巴胺纳米粒的影响的研究相对较少，本研究利用一系列梯度值为0.5（pH7.5-9）的pH值，通过诱发多巴胺的自氧化制备了聚多巴胺PAR，研究了聚多巴胺纳米粒子的形成动力学和性质和性能。此外还探讨了载药纳米粒用于药物治疗的可行性，CPT是一种生物碱类抗癌药物，通过作为拓扑异构酶抑制剂阻断细胞复制过程而抑制多种肿瘤。
  2. 材料和方法

2.1 PDA纳米颗粒的制备

总共0.2g多巴胺、盐酸(Sigma-Aldrich，圣路易斯，密苏里州，美国)溶于200mL来自Milli-Q系统的超纯水(18.2mxcm)。(美国马萨诸塞州贝德福德毫微孔)，使用5M氢氧化钠溶液将溶液pH调节到7.5、8、8.5或9。在60℃下用磁力搅拌器搅拌。DA聚合反应速率为500转/分。为了去除Na , Cl-，和聚合型DA分子，PDA纳米颗粒用去离子水冲洗，在转速为18500转条件下离心后收集产物(Avanti J-E，Beckman Coulter，Fullerton，CA，USA)。然后将PDA纳米粒子储存在-20℃环境中，冷冻干燥(FDU-1200，EYELA，(日本东京)。

2.2 PDA纳米粒子性质

为探讨PDA纳米粒子的形成机理，需要一台数位pH计(SP-701型，Suntex，大培，台湾)和UV-vis分光光度计(Helios ZetaUV-vis，Thermo Science，Loughborough，UK)。用于现场监测不同时间段反应液中DA的pH值和吸光度的变化。在每个反应终点，在900mL的分散水中加入100 laliquot的反应液，测定400 nm处的吸光度。分别进行了三组实验：将PDA溶液滴入包覆的铜板上，通宵风干，并用透射电镜观察PDA粒子的形貌，以确定PDA粒子的形貌。(TEM；JEM-1400，JEOL，东京，日本)。在不同pH值的前驱体溶液中合成的PDA纳米粒子在不同的pH值下反应6h，得到的PDA纳米粒子的流体动力学尺寸分布如下：
使用粒度分析仪(N4 Plus，Beckman Coulter，Fullerton，CA)，通过动态光散射(DLS)测定了在蒸馏水中再悬浮的PDA纳米颗粒的含量。利用傅里叶变换红外光谱(FTIR；Bomem DA8.3，Hartmanamp;Braun，Canada)和固态13C核磁共振(NMR；DSX400 WB，Bruker，Karlsruhe，德国)研究了PDA纳米粒子的化学结构。用Zetasizer纳米ZS测定仪测定了PDA在不同pH值的磷酸盐缓冲溶液(PBS)中的Zeta电位。（英国夏尔)。

2.3 CPT装载与释放

将10 mg的PDA纳米粒子和0.25 mg的CPT(Sigma-Aldrich)分别置于2mL甲醇中，室温下孵育24h，制备载药CPT@PDA微球。以13000rpm离心分离负载PDA纳米颗粒，去除空载药物和甲醇。然后用蒸馏水清洗CPT负载的PDA纳米粒子三次，使用前-20℃保存。为了评估载药量，采用紫外-可见分光光度计(ThermoScience)测定药物在360 nm处的吸光度。用不同浓度的CPT(0.125 mg/mL甲醇)稀释成不同浓度的标准曲线，对载药量进行了测定。浓度在0.997.0 5~10 lg/mL范围内，R2相关系数为0.0 5~1 0.0 1/mL。将2 mg负载CPT的PDA纳米粒在1mL磷酸盐缓冲液(pH7.4)中浸泡，每隔37℃，取PBS释放介质取样，用新鲜PBS代替，用紫外-可见分光光度计测定药物释放量。分析是在三套不同的实验中进行的。以PbS为溶剂，用四甲基偶氮唑盐作溶剂，绘制了标准曲线相关系数(R2）为0.999。

2.4 PDA纳米粒子的血液相容性研究

取健康供者的全血标本5mL，加入10mL PBS中。用10，400rpm离心分离红细胞(RBC)，然后用PBS洗涤5次，再悬浮于50mL的PBS中。用不同浓度(1，10，50，100，200，10，50，100，200)的红血球细胞共培养20个micro;L细胞(5times;107细胞)。4个初始pH值分别为500和1，000 micro;g/mL的PDA纳米粒子，室温下在1 mL PBS溶液中反应6 h，制备的PDA纳米粒子质量浓度分别为500和1，000 micro;g/mL。然后离心得到上清液，用Tecan奥地利Gesellschaft，Salzburg，Salzburg公司的平板测定仪测定570 nm处的吸光度，参考值为655 nm[21]。红细胞的吸光度。去离子水和PBS分别作为阳性和阴性对照。数据是三个独立实验的代表。

2.5 PDA纳米粒子的细胞生物相容性

两种不同类型的人腺癌细胞系。采用肺泡上皮细胞(A549细胞；BCRC60074，台湾新竹)和人宫颈癌细胞(HeLaCells；BCRC 60005)作为研究对象。这些细胞接种在96孔板上，密度为5，000CELL/WELL和Dulbeccolsquo;s Modified Eagle。培养基(DMEM；Gibco，Grand Island，NY，USA)，含10%胎牛血清(Gibco)和1%胎牛血清、青霉素(10，000U/mL)/链霉素(10，000micro;g/mL)溶液(赤霉素)，37℃，5%CO224小时。然后，在DMEM中加入不同浓度的PDA纳米粒子(0.1、1、5、10、25和50micro;g/mL)加到盘子里。再培养24h后，去除培养液，用PBS清洗细胞3次。加入200micro;L浓度为2 mg/mL的3-(4，5-dimethyl-thiazol-2-yl)-2，5-diphenyltetrazolium溴甲烷溶液，37℃孵育2h。然后加入100micro;L的二甲基亚砜(Sigma-Aldrich)溶解紫色晶体。用日出微孔板测定仪测定了550 nm处的吸光度，参比波长为650 nm。细胞培养于无PDA的平板上作为对照。细胞活力按光密度归一化培养板。为每组提供的数据是三项独立测量的平均值。

2.6 载药纳米PDA的细胞毒性研究

在pH8.5的初始溶液中制备的聚多巴胺纳米颗粒用于评价载药细胞的细胞毒性。将A549细胞或HeLa细胞接种在密度为5，000个/孔的96孔板上，加入含10%胎牛血清和1%青霉素/链霉素溶液的DMEM，37℃，5%CO2环境下培养24 h。然后，将细胞与含有不同浓度的PDA纳米颗粒、游离的CPT或负载CPT的PDA纳米颗粒的培养基共同孵育。为了比较，在培养基中加入0.125 mg/mL的甲醇中游离CPT药物，制备了6种不同浓度的CPT。(0.001.5、0.0 1、0.0 5、0.1、0.2 5和0.5micro;g/mL)。培养24h后，用MTT法检测载药纳米颗粒对细胞活力的影响。以无佐剂培养板上培养的细胞作为对照。细胞活力按光密度归一化培养板。实验结果来自三个不同的实验。

  1. 结果和讨论
    1. PDA纳米粒子的形成

如图所示，对DA聚合反应过程中的pH值进行了监测。可以清楚地看到。不同初始pH值的DA溶液的pH值在开始6h内迅速下降到4.6~5.6之间，然后趋于稳定。值得注意的是，不管溶液的初始pH值如何。当反应时间为6h时，pH下降速率(*-0.5pH单位/h)基本不变。根据文献，讨论了DA聚合的机理。在碱性pH条件下，DA被氧化，转化为多巴胺醌(DQ)。然后DQ经历了一个不可逆的分子内1，4迈克尔加成环化，将DQ转化为白血糖胺类化合物(LDC)。
LDC可以被氧化成amonochrom(AC)，重组成5，6-二羟基吲哚(DHI)，聚多巴胺的单体.在这一系列的氧化和聚合过程中，释放质子使反应溶液的pH值降低。

图一：不同初始pH值下DA溶液pH值和b吸光度的原位变化

图二：PDA在不同pH值的PBS溶液中反应6h后zeta电位的变化

利用紫外-可见光谱进一步探讨了初始pH值对PDA形成机理的影响。Yamada等人结果表明，在紫外-可见光谱中，340-400 nm的宽带与醌类和胺类化合物形成1，4-michael加成反应有关，而后者又进一步被氧化并聚合成PDA。因此，在我们的工作中，我们用400 nm处的吸光度来评价PDA的形成。图1b显示，随着初始pH的增加，最大吸光度增大，这表明较高的初始pH有利于DA氧化聚合到PDA。在初始pH为7.5、8、8.5和9的条件下合成6 h的PDA，再用原DA干重除法测得PDA的得率分别为3%、7%、20%和34%，并对合成的PDA进行了结构表征，结果表明：在pH7.5、8、8.5和9的条件下，合成的PDA的得率分别为3%、7%、20%和34%。确定了初始pH对PDA生成量的加速作用。值得注意的是，在初始pH值为8、8.5和9的DA溶液中，反应时间为2、4.5和9h后，DA溶液的吸光度分别下降。这一结果可能被解释为由于PDA在酸性pH环境中没有表面电荷而导致粒子的聚集。
图2显示了在不同pH值的PBS中，反应6h后，在不同的初始pH值下合成的PDA的zeta-电位。PDA的zeta电位与所用DA溶液的初始pH无关，但与测试PBS的pH值有关。在PBS测试pH为3时，PDA纳米粒子的zeta电位为*0 mV，随着测试pH的升高，zeta电位变为负值。当pH为7时，Zeta电位为*-14 mV。这一结果与其他研究者的报道是一致的，他们发现PDA胶囊在pH8.5的磷酸二钠-柠檬酸缓冲溶液中的zeta电位为-49.5 mV，并正移至-5.15 mV，而PDA胶囊在pH8.5的磷酸二钠缓冲溶液中的zeta电位为-49.5 mV，而PDA胶囊的zeta电位正移至-5.15 mV。在酸性条件下，pH值低至3.8。这一结果是由于PDA的酚基和氨基的亲核/去质子化作用所致。

图3：不同初始pH值下合成的PDA纳米粒子的TEM图像随时间的变化关系。原始放大率，100kx。比例尺200 nm

PDA在不同初始pH下的TEM图像。解的值作为时间的一个有趣的部分如图3所示。结果表明，在pH7.5、8、8.5和9的条件下，反应1h后可形成直径分别为250、150、100和50 nm的球形颗粒。粒径随反应时间的延长而增大，在pH7.5、8、8.5和9条件下合成的纳米PDA在6h时粒径分别为400 nm、250 nm、150 nm和75 nm，此后未见明显增加，而在pH7.5、8、8.5和9条件下合成的纳米PDA粒径分别为*400 nm、250 nm、150 nm和75 nm。在对DA的早期氧化产物进行表征的研究中，Bisaglia等人发现，动力学常数随着溶液pH值的增加而增加。较高的pH条件下生成的较高的动力学常数促进了PDA纳米颗粒的成核，从而使粒径较小的颗粒具有较高的产率。与此不同的是，当反应时间延长到9或12 h时，降低的溶液pH值限制了DA的聚合，这是由于

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资料编号：[962]

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