用于靶向传递到肿瘤细胞的适配体-药物偶联物的分子组装外文翻译资料

 2022-01-30 20:51:14

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用于靶向传递到肿瘤细胞的适配体-药物偶联物的分子组装

摘要

将抗肿瘤药物与抗体等靶向试剂结合，是提高化疗疗效、降低化疗总毒性的一种切实可行的方法。本文将抗肿瘤药物阿霉素（Dox）共价连接到DNA适配体Sgc8c上，并用细胞选择法（cell-SELEX）对制成的偶联物进行筛选。在此过程中，我们期望这种Sgc8c-Dox结合物能够特异性地杀死靶细胞CCRF-CEM (T细胞急性淋巴细胞白血病细胞，T-cell ALL)，而对非靶细胞无毒性作用。结果表明，Sgc8c- Dox偶联物具有许多Sgc8c适配体的性质，包括高结合亲和力(Kd = 2.0plusmn;0.2 nM)，以及被靶细胞有效内化的能力。此外，由于特定的偶联方法，连接Sgc8c-Dox偶联物的酸不稳定链可以在酸性内体环境中被裂解。细胞活力试验表明，Sgc8c-Dox偶联物不仅具有与未偶联的Dox类似的效力，而且具有目前大多数靶向药物传递方法所缺乏的分子特异性。此外，我们发现，通过将药物与适配体连接，可以有效抑制非靶细胞对膜透性Dox的非特异性摄取，从而使偶联物对表达较多靶蛋白的细胞具有更好的选择性。与已有报道中效果较差的Dox免疫偶联物相比，这种Sgc8c-Dox偶联物使靶向化疗更可行，也使药物可以发挥更好的效力。与最近大量专门针对多种癌细胞的DNA适配体结合，使这种药物偶联方法对靶向药物的传递具有更为广泛的意义。

关键字

适配体;阿霉素;CCRF-CEM;靶向药物输送;癌症治疗

介绍

普通化疗药物对肿瘤细胞特异性的缺乏往往会使接受传统癌症化疗的患者遭遇可能危及生命的毒性作用。为了克服这一问题，提高癌症治疗的选择性，细胞毒性药物应该被送到肿瘤生长的特定部位。为此，生物化学合成的配体-药物结合物发挥了重要作用。例如，将可以和癌细胞表面特定标记物特异性结合的单克隆抗体（mAb）与针对特定癌症种类的药物共价连接。这些单克隆抗体免疫偶联物可以选择性地将药物传递到肿瘤部位，从而提高治疗肿瘤的效果，同时降低其全身毒性。虽然一般的免疫偶联物都是用功能和效力范围广泛的药物制成的，但到目前为止，只有结合具有更高药效药物的免疫偶联物在临床前的模型中才显示出较为惊艳的结果，并且这些药物目前都正在临床试验前的评估。其中一种先进的药物是人源化抗CD33的抗体与杯霉素的结合物Mylotarg，该药物已获得批准，用于急性髓细胞白血病（AML）的治疗。

近年来，一种单链寡核苷酸，称为适配体，作为一类新型的分子，在治疗和诊断应用中都展现出可以与抗体相抗衡的性质。相比于抗体，适配体更稳定，易于合成，修改和操作。可结合特定靶点的适配体选自一个称为SELEX的过程（配体通过指数富集的系统进化）。经过几个选择周期，DNA或RNA池中的适配体可通过重复结合其靶分子而被选择性的富集。最近，细胞SELEX已被开发用于产生适配体，以特异性识别目标肿瘤细胞，如T细胞急性淋巴细胞白血病细胞（T-cell ALL）、小细胞肺癌细胞和肝癌细胞等，这些癌细胞的适配体可以相对容易地进行筛选。筛选出的适配体对不同类型的肿瘤细胞具有高度特异性，并具有良好的亲和力。由于它们能在分子水平上提供特异性，我们相信这些适配体可用于提高实验和商业药物在临床应用中的疗效。因此，需要利用分子工程技术创造具有特异性和较好药效的分子结合物。

在本报告中，我们探讨了靶向药物治疗中，以cell-SELEX筛选出的DNA适配体为核心设计制作的适配体药物配合物，在分子工程方面的应用。具体来说，我们使用DNA适配体Sgc8c作为靶向特定肿瘤细胞的药物载体，该适配体可识别人T细胞中所有的CCRF-CEM细胞系。Sgc8c可以识别蛋白酪氨酸激酶7（PTK7），一种在CCRF-CEM细胞上高度表达的跨膜受体，并对其具有很高的结合亲和力(K ~ 1 nM)。Sgc8c的高特异性和特征性DNA结构使其能够区分白血病细胞和正常人骨髓细胞，以及在临床标本中识别与靶细胞系密切相关的癌细胞。最近，我们还证明Sgc8c与目标蛋白结合后可以内化到靶向细胞中。基于这些原因，Sgc8c被认为是概念验证的良好候选。阿霉素（Dox）是最常用的抗癌药物，可治疗多种肿瘤，包括急性淋巴细胞性白血病和骨髓母细胞性白血病以及恶性淋巴瘤。然而，Dox在癌症治疗中的疗效伴随着骨髓抑制、粘膜炎、脱发以及最令人担忧的累积性心脏损伤等毒性作用。因此，我们通过一种简单的共轭方法将Dox分子组装到我们的适配体探针中，以证明这种靶向特异性方法在细胞内药物传递中的可行性。

结果和讨论

Aptamer-Dox共轭物易于制备

制备Sgc8c-Dox共轭物的合成方法如方案1所示。为了在内化后释放结合物中的化学治疗剂，我们选择了一个腙连接体用于结合Dox和Sgc8c。几项研究已经证明，Dox C-13 腙衍生物具有类似于Dox的细胞毒性作用，并且在结合后可以于ph 4.5–5.5的环境中释放Dox，通过高效液相色谱纯化Sgc8c-Dox共轭物，并针对缓冲液(10 mM Tris-HCl, pH 7.4)透析12h去除物理共轭的Dox，然后通过495 nm处的紫外吸收(ε495 = 12000 cm M)测定Dox的量，而Sgc8c的量则通过260 nm处的吸收根据公式计算（a是在指定波长下观察到的吸光度），包括对同一波长（ε260=24000 cm m）下ox吸光度的校正。我们得到的Dox:Sgc8-c比值约为0.5，这表明仍有一些未结合的Sgc8c与共轭的Sgc8c没有很好地分离。寡核苷酸的分子探针通常被认为是稳定，易于合成、操作和处理。它们能够承受高温和极端的酸碱环境等恶劣条件，并且可以在没有稳定试剂的情况下长期保存。使用本文描述的分子工程策略，我们能够轻松地将单个Dox组装到Sgc8c适配体中。根据这种方法，我们还认为在一个适配体中以类似但可控的方式组装多个DOX分子是可行的，但是在目前基于单克隆抗体的免疫结合方法中，这一操作相对难以实现。

Aptamer-Dox共轭物与靶癌细胞保持特异性结合和高亲和力。

尽管大多数基于寡核苷酸的分子探针可以在3′或5′端进行修饰而不影响其生物学性质，但有必要确认新合成的Sgc8c-Dox共轭物的特异性。为了评估结合物与靶细胞的结合效果，首先对结合物进行孵化，然后对标记为Sgc8c的荧光蛋白进行孵化，然后通过流式细胞术测定荧光强度。在结合位点已经被Sgc8c-Dox饱和后，从CCRF-CEM细胞检测到较少的荧光的观察证实，Sgc8c-Dox结合物对CCRF-CEM细胞的结合是通过Sgc8c对其靶点的特异性结合。还应注意的是，通过腙连接体将Dox结合到Sgc8c对和适配体靶向到CCRF-CEM细胞的能力没有影响。具体来说，通过定向荧光测量确定Sgc8c-Dox的结合亲和力（Kd）为2.0plusmn;0.2 nm。该结果与未结合的Sgc8c相当。

Aptamer-Dox共轭物具有类似于未结合母体DOX的药物疗效。

为了评价DOX分子组装后的细胞毒性作用，选择人白血病细胞株CCRF-CEM进行抗癌药物检测。用MTT（3-（4,5）-二甲基噻唑-2-基）-2,5-二苯基四唑溴化铵）法测定Sgc8c-Dox处理的细胞在0～2.5mu;m浓度范围内的相对存活率。所示结果表明，Sgc8c-Dox的抑制浓度（ic）为0.32plusmn;0.04mu;m，与游离Dox完全相同（ic=0.32plusmn;0.03mu;m）。我们还研究了游离SGC8C的细胞毒性作用，发现其对CCRF-CEM细胞的固有毒性小于20plusmn;5%。基于这些结果，我们可以得出结论，我们的适配体Sgc8c-Dox结合物的药理成分在癌症治疗中仍然具有很高的效力。Sgc8c-Dox与游离Sgc8c具有不同的细胞毒性作用，我们也可以排除适配体本身的任何可能毒性。

Dox在肿瘤治疗中发挥着重要作用，被认为是世界上最常用的抗癌药物。然而，其阻止细胞增殖的功能只发生在插入细胞核中的DNA时。有几项研究表明，游离Dox具有膜透性，可以通过被动扩散机制被细胞吸收，迅速转运到细胞核，并容易与染色体DNA结合。在15分钟内，用Dox处理的细胞在细胞核区域已经显示出强烈的红色荧光，这表明大多数Dox都是通过被动扩散机制被细胞吸收的。我们先前的内化研究显示，Sgc8c在与结合受体后，可以被CCRF-CEM细胞特异性地吸收；然而，研究表明Sgc8c更倾向于积聚在内质室中。因此，为了证明Sgc8c-Dox结合物与未结合的Dox相比具有相似的细胞毒性，我们通过共聚焦显微镜监测Dox的红色荧光来跟踪Sgc8c-Dox结合物的细胞内分布。通过同时用Sgc8c-Dox和alexa633标记的转铁蛋白(transferrinAlexa633)培养细胞，我们能够追踪Sgc8c-Dox和内质室的位置。30分钟的孵育后，大多数Sgc8c-Dox与转铁蛋白共定位，表明这些结合物仍然被内化进入内质室。然而，1小时后，一些红点（Dox信号）扩散到胞质溶胶中，2小时后，红点在细胞内逐渐均匀分布。我们认为，正是内质室的酸性环境分解了酸性不稳定连接体，并允许Dox快速转运到细胞核并在细胞核中发挥作用。这一点得到了我们发表的结果的支持，因为荧光共轭物不耐酸，所以在同一时间点荧光载体结合的Sgc8c在胞质溶胶中没有积累。

根据文献，有几项体外研究表明，Dox的抗体免疫偶联物只有中等效力，往往比母体药物活性低，因此，免疫偶联物通常需要IC值在0.01-0.1nm范围内的高效力药物，才能实现对肿瘤细胞系的成功治疗。与此同时，我们的Sgc8c-Dox结合物与靶细胞中的游离Dox具有一样的效力，这意味着在将来的结合物中不需要使用高效药物。与免疫偶联物相比有明显的改进，这种改进的有效性可能是由于适配体结合物的高亲和力，以及目标细胞对适配体的有效内化。

Aptamer-Dox共轭物对靶癌细胞的杀伤具有良好的特异性。

我们还通过比较不同的适配体与Dox的结合物对CCRF-CEM细胞的细胞毒性作用以检测Sgc8c-Dox的特异性。TDO5适配体可特异性结合到人类伯基特淋巴瘤细胞系Ramos，因此可作为阴性对照，以显示Sgc8c-Dox结合物的特异性。用0～2.5mu;m的TDO5-Dox孵育细胞，MTT结果显示细胞毒性（小于21plusmn;10%），与游离Sgc8c的结果相似。此外，在0.5mu;m的TDO5-Dox孵育2h时，共聚焦显微镜显示细胞内荧光较少。说明Dox的非特异性吸收由于与对照的DNA 适配体TDO5连接而最小化。这项比较研究提供了有力的证据，证明TDO5-Dox没有内化，而Sgc8c-Dox可以识别并被其靶细胞特异性吸收。因此，很明显只有能结合并被靶细胞内化的适配体的结合药物才能在细胞内传递药物并抑制细胞生长。

Sgc8c-Dox通过受体介导的摄取发生内化。

我们进一步利用Dox的荧光特性进行细胞摄取研究。尽管Dox的荧光在与我们的适配体结合后下降了大约5倍（数据未显示），但在用游离的以及与适配体结合过的两种不同Dox孵育细胞后，我们仍然能够通过流式细胞术监测其荧光。在三个清洗循环去除未结合的Dox后，显示了不同药物浓度Dox处理后的CCRF-CEM细胞的荧光强度。需要注意的是，荧光信号来自细胞内和细胞膜上，但只有细胞内的药物才能起作用，所以我们用胰蛋白酶去除表面结合的药物。胰蛋白酶处理后，荧光信号与不同的Dox浓度呈线性关系。这一结果与Dox在细胞内的被动扩散现象相吻合，因为简单扩散的质量运输与浓度梯度成正比。然而，从Sgc8c-Dox信号中减去非特异性相互作用的TDO5-Dox的荧光强度后，我们观察到细胞摄取的不同曲线。Sgc8c-Dox的荧光强度在0.5mu;m后呈线性增加，最后达到饱和，该曲线的饱和证明Sgc8c-Dox的内化是以受体依赖的方式发生的，这与自由Dox的被动扩散不同。在高共轭浓度下，所有结合位点都被占据，不再有内化。

流式细胞术定量的荧光信号与细胞毒性结果吻合较好。例如，在浓度高于125nm的情况下，Sgc8c-Dox显示出比TDO5-Dox更强的效力。同样，Sgc8c-Dox和TDO5-Dox的荧光差异在125nm处开始增大。此外，在0.5mu;m以上的浓度下，Sgc8c-Dox对细胞的毒性以及Sgc8c-Dox和TDO5-Dox之间的荧光差异均达到了最大。

通过比较不同适配体（Sgc8c和TDO5）结合药物的荧光信号和细胞毒性效应的不同表现，我们的研究表明Sgc8c对膜透性药物的靶向输送是有用的。曾被报道过的前列腺特异性膜抗原（PSMA）RNA适配体是一种可以促进凝胶蛋白（一种自身无法穿透细胞膜的核糖体毒素，即使浓度很高）摄取的适配体，与其相比，本方案中DNA适配体的结合策略，使适配体更适合作为向肿瘤细胞提供毒性药物的载荷体，特别是对于具有膜渗透性但对靶细胞无特异性的抗癌药物。

Sgc8c-Dox结合物对不同癌细胞具有选择性杀伤作用。

为了进一步证明适配体可用于靶向药物传递，我们测试了我们的Sgc8c-Dox对另外两个细胞系NB-4和Ramos细胞的细胞毒性。对于CCRF-CEM、NB-4和Ramos细胞，自由Dox的IC分别约为0.32plusmn;0.03mu;m、0.49plusmn;0.07mu;m和1.46plusmn;0.22mu;m。然而，我们的Sgc8c-Dox结合物对CCRF-CEM细胞的毒性约为对NB-4细胞的毒性的6.7倍。对Ramos细胞而言，对CCRF-CEM细胞的选择性更好，因为Ramos细胞中的毒性基本上在测试的最高浓度下平稳，没有迹象表明进一步增加会导致额外的毒性。我们还用TDO5-Dox对这三个细胞系进行了额外的实验。比较流式细胞术中标记（R-藻红蛋白）-Sgc8

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