更昔洛韦酯类前药的合成，理化性质和抗病毒活性外文翻译资料

 2022-03-12 15:39:42

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更昔洛韦酯类前药的合成，理化性质和抗病毒活性

摘要

本研究的目的是合成一系列更昔洛韦（GCV）的二酯前药，用于改善眼部和口腔的生物利用度和治疗活性。测量GCV前药的溶解度，logP，pH稳定性曲线，体外抗病毒活性，细胞毒性，抑制曲线和眼组织水解。发现Val-Val-GCV和Val-Gly-GCV二酯与Val-GCV和Gly-Val-GCV相比表现出更高的水稳定性，而眼组织水解证明Val-Gly-GCV和Gly-Val-GCV更稳定。 Val-Val-GCV和Val-GCV二酯是最亲脂的化合物，并且预测分别具有比GCV高295倍和12倍的分配系数。所有前体药物具有比母体药物GCV高得多的水溶性。兔眼中的体外摄取表明前药具有高摄取潜力。与GCV相比，前药显示细胞毒性没有增加，相反，其对人巨细胞病毒（HCMV）以及HSV-1和HSV-2的效力显着增加。与目前使用的药物相比，这应该使治疗反应在更低的浓度下可以更容易地实现。总之，二酯GCV前体药物表现出优异的化学稳定性，高水溶性和显着增强的对抗疱疹病毒的抗病毒效力，而不增加细胞毒性。

关键词：更昔洛韦;肽;二酯;前体药物;酯化; 抗病毒活性

1.介绍

通常影响视网膜的疾病包括细菌性眼内炎和巨细胞病毒（CMV）视网膜炎。人巨细胞病毒（HCMV）是一种机会性疱疹病毒，可引起新生儿，器官移植受者，癌症和艾滋病患者等免疫不成熟或受损的宿主的严重感染（Crowe等，1991; Drew，1992）。巨细胞病毒性视网膜炎发生在约20 -30％，尤其是CD4细胞计数低的患者（Luckie，1995; Masur等，1996）。 HCMV视网膜病变是由病毒复制和病毒引起的诱发视网膜炎症。已知感染首先出现在视网膜的内层，然后向外扩散到包括视网膜色素上皮（RPE）的所有其他层。视网膜内皮细胞内的病毒复制是疾病进展的关键因素，并发生在最终的内皮细胞，RPE和视网膜胶质细胞中（Burd等，1996）。视网膜内皮细胞被认为是视网膜感染的主要部位，他导致了血液-视网膜屏障的中断，从而促进了感染向RPE的扩散（Bodaghi等，1999）。局灶性淡黄色白色颗粒状斑片，弥漫性水肿和伴有坏死的视网膜出血是晚期CMV视网膜炎的症状，如果不治疗可导致失明。

阻止分子从全身循环进入眼部隔间的阻挡层的两个主要成分是血-视网膜屏障

（BRB）和前段血-水屏障（BAB）。BRB和BAB一起形成血液屏障。BRB防止药物从脉络膜进入视网膜。如何把药物输送到眼睛后部，包括视网膜，脉络膜，玻璃体液和巩膜，是制药行业面临的最有趣和最具挑战性的任务之一。由于房水的持续引流，药物从前房到后房的传递将不是一个有效的过程。

迄今为止，9-（1,3-二羟基-2-丙氧基甲基）鸟嘌呤（GCV）是治疗CMV视网膜炎的首选药物（Laskin等，1987; Buhles等，1988）。事实上，据报道，GCV体外抗HCMV的效力比阿昔洛韦（ACV）强26倍（Morse等，1993）。然而，口服GCV的人体生物利用度在2.6-7.3％之间（Spector等，1995）。和其他核苷类似物如三氟尿嘧啶（TFT）以及ACV一样，GCV具有亲水性，跨越膜具有较差的跨细胞渗透性（Kulikowski，1994）。更昔洛韦的低眼生物利用度是由于其较差的水溶性和低亲脂性（Kenley et al，1986; Benjamin et al，1987），导致制剂困难和难以送入眼内。口服或静脉内给药后，血-眼屏障阻止治疗浓度的GCV渗透到眼睛的前房和后房（Arevalo等，1995; Cunha-Vaz，2004）。因此，目前的治疗策略要求通过玻璃体内注射或与全身给药联合手术植入玻璃体植入物（Henry et al，1987; Morlet et al，1996; Cadman，1997年a，b）中。 但是这些药物递送到眼中的技术容易导致继发感染，视网膜脱离和玻璃体出血的高风险（Martin等，1997）。

增强GCV渗透到视网膜和角膜组织中的策略可使得治疗选择和功效的显着改善，

反过来可能导致药物管理或手术的频率降低。亲水性化合物的亲脂性前体药物衍生化是一种可以使跨细胞膜增强分配的策略。有人对一系列单酰基酯和二酰基酯GCV前药进行了评估，试图改善这种抗病毒剂的眼部生物利用度和功效（Dias等人，2002）。尽管GCV的亲脂性酰基酯前体药物具有相同的GCV体外抗病毒活性，但增强的亲脂性和较差的水溶性限制了它们作为局部，玻璃体内或全身性药物的用途。因此，转运蛋白靶向药物衍生化是目前研究人员正在探索的一项新兴技术（Duvvuri等，2003）。在该策略下，前药被设计为靶向在选定组织上表达的膜转运蛋白。摄取后，前药通过细胞酶迅速转化为母体药物。这种策略也可能导致母体药物溶解度的显着提高，具体取决于其突变性。

对于靶向药物递送，肽转运蛋白（PepT1和PepT2）可能是药物转运蛋白，由于它们具有广泛的底物特异性而引起了最多的关注（Amasheh等，1997; Balimane等，1998）。

通过肽转运蛋白靶向药物建模获得了几种药物递送方面的成功。由于PepT1介导的转运，GCV和ACV的1-缬氨酸酯前药，缬更昔洛韦（Val-GCV）和伐昔洛韦（Val-ACV）分别显示母药的肠吸收显着增强（Steingrimsdottir，2000; Sugawara等，2000; Hoglund等，2001; Reusser，2001）。由于肽转运蛋白（PepT1）在角膜上皮上表达，并且Val-Val-ACV是该转运蛋白的底物，因此观察到角膜渗透增加（Anand等人，2003）。神经视网膜是CMV病毒的活性复制位点（Burdet等，1996）。由GCV前药导致的视网膜细胞中更高的细胞内GCV浓度可显着改善GCV在CMV视网膜炎中的功效。

因此，本研究的总体目标是合成一系列高水溶性单肽和二肽二酯GCV前药（图1），并描绘其理化性质，pH稳定性分布，眼组织水解， 体外抗病毒活性和细胞毒性。 我们选择Val-Val，Gly-Val和Val-Gly作为前导候选物，因为我们早先合成了含有这些部分的前药，并且发现它们是很好的候选物（Anand等，2003）。

2.材料和方法

GCV是作为Hoffman La Roche（Nutley，NJ）的礼物获得的。Dulbecco的改良培养基包含：营养混合物F-12（Ham）（1:1）（DMEM / F12）和胎牛血清（FBS）分别购自Gibco（Invitrogen Corporation，GrandIsland，NY）。所有其他化学品和溶剂都是试剂或分析级（Sigma Chemical Company，St.Louis，MO）并且不经进一步纯化而使用。蒸馏水，去离子水用于制备缓冲液和流动相。新西兰雄性白化兔，重2-2.5公斤用于眼科研究。用配备有组合电极的125型pH计进行pH测量。所有化合物的质谱均通过带ESI离子源的Thermo-Finnigan LC / MS。使用柱和输注注射方法来获得质谱。通过布鲁克250MHz NMR和样品溶解在d6-DMSO中，并收集光谱。

2.1 GCV前药的合成

方案1中显示了GCV二肽合成的方法。将BOC-缬氨酸（3.4g，15.7mmol），DCC（1.6g，7.8mmol）和20ml无水二甲基甲酰胺（DMF）加入到100ml烧瓶中，混合物在0℃搅拌1小时。在搅拌过程中产生二环己基脲（DCU）的白色沉淀。向反应烧瓶中加入1.0g的GCV（3.9mmol）和0.24g的DMF溶液，滴加4-二甲基氨基吡啶（DMAP，2mmol）。将反应混合物在0℃保持1小时，并在室温下连续搅拌24小时。过滤除去尿素衍生物。在真空除去DMF后，将30ml乙酸乙酯加入到残余物中。该溶液分别用10ml饱和碳酸氢钠溶液和20ml盐水洗涤。收集有机层并经MgSO 4干燥。除去大部分溶剂后，将残余物装载到硅胶柱上并用1:7的甲醇/二氯甲烷混合物纯化。将得到的白色固体BOC-Val-GCV二酯溶解于20ml TFA中，并在0℃下搅拌1小时至除去BOC组。在真空中除去TFA后，将20ml乙酸乙酯加入到油性残余物中。然后将溶液逐滴加入冷乙醚中。过滤后，收集到高纯度（gt; 95％）的2.5g Val-GCV二酯（二-TFA盐），为白色固体。四毫升三乙胺（TEA，28mmol）加入到Val-GCV二酯中并保持15分钟，然后将其溶解于15ml DMF中。将混合物逐滴加入通过前述相同方法制备的BOC-甘氨酸盐酸盐溶液中，并在室温下搅拌过夜。然后进行与前述相同的纯化和脱保护程序。总体而言，收集到白色粉末中的2.54g纯Gly-Val-GCV二酯（二TFA盐），产率为82％（来自GCV）.而方案2（Nashed and Mitra，2003; Gao，2000），Val-Val-GCV的合成程序基本上与描述过的一致力，唯一的不同是其开始于Gly-GCV二酯的合成。

2.2 理化性质

2.2.1水溶性研究

水溶性研究在pH 3.4，在强度为62.5mM的邻苯二甲酸盐缓冲系统中进行。将过量的药物加入玻璃瓶中的1ml缓冲液中，并置于25℃和60rpm的振荡水浴中24小时。 在这段时间结束周期内溶液以12,500rpm离心10分钟，上清液通过0.45mu;mNalgene注射器滤膜过滤。 再次测定pH值以检查是否有任何变化，但pH只有轻微变化。 样品的分析在取样后15-20分钟内完成，防止任何沉淀。 最初的0.5ml滤液作为附加的预防措施被丢弃以避免前药吸附到过滤膜上。 溶解度研究一式两份进行。药物浓度使用HPLC分析确定。

2.2.2 分配系数

使用ACD Labs软件，ACD / I-Lab Web服务（ACD / LogP 7.04）估计log P（正辛醇/水）值。

2.2.3 PH稳定性研究

GCV前药的化学稳定性在不同的pH值下进行检测：1,3,5-9。本研究使用邻苯二甲酸盐（pH 3和5），磷酸盐（pH 6和7）和硼酸盐（pH 8和9）缓冲液。在所有情况下，用氢氧化钠/盐酸将溶液的pH值调整到目标的plusmn;0.02单位内。用盐酸制备pH1的缓冲液。研究了每种前体药物的降解曲线，在三种不同的缓冲强度下（25,50和62.5mM）。用KCl将所有缓冲液的离子强度调节到0.1M。取缓冲液的等分试样（9.9ml）放入玻璃瓶中，并在水浴中平衡至37◦C。即将开始实验之前，在水中制备每种前药的储备溶液（10mg / ml）。然后将100微升原液加入9.9毫升缓冲液中（预先加热至37℃），得到最终前药浓度为100微克/毫升。在实验期间将小瓶置于37℃和60rpm的振荡水浴中。样品（100mu;l）以预定的时间间隔取出并立即储存在-80℃直至进一步分析。冷冻样本，解冻并立即通过HPLC分析。所有实验一式三份进行。

2.2.4 HPLC分析

通过HPLC系统分析稳定性和溶解度样品，所述HPLC系统包括HP 1050系列四元梯度泵，Alcott 718AL冷冻自动贴片机，HP 1100系列荧光检测器（lambda;激发265nm和lambda;发射380nm），HP 3395集成电路，Phenomenex C18（4.6times;250）柱和C18保护柱。 流动相由15mM磷酸盐缓冲液（pH 2.5）和乙腈组成。 取决于所分析的前药，乙腈的比例是不同的。 分析方法在精密度（％R.S.D。lt;1）线性（r2gt; 0.998），再现性（％R.S.D。lt;2）和选择性（未观察到干扰峰）方面进行了验证。

2.3 眼组织水解研究

2.3.1 眼组织的制备

本研究使用新西兰白化雄性兔子。通过边缘耳静脉注射戊巴比妥钠致死注射使动物安乐死。立即将每只眼睛摘除，并用生理盐水冲洗眼表并吸干。在巩膜-边缘连接处切开，切开眼后节。使用结核菌素注射器取出玻璃体液。神经视网膜，视网膜色素上皮-脉络膜和巩膜分次被去除。使用前，所有组织均储存在-80℃。在冰浴中用组织匀浆器将组织在10ml冷冻（4℃）等渗磷酸盐缓冲溶液（IPBS）中匀浆约4分钟。将匀浆液在4℃以12,500rpm离心25分钟以除去碎片，将由此获得的上清液用于水解研究。通过使用牛血清的BioRad测定法测定每种上清液的蛋白质含量，以白蛋白作为标准。

2.3.2 水解时间

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上清液在37℃水浴中平衡约30分钟，然后进行实验。 通过将0.6ml前药在IPBS溶液（0.1mM）中加入到2.4ml上清液中开始该研究。对照由0.6ml前药溶液和2.4ml IPBS代替上清液组成。 以适当的时间间隔取样（50mu;l），立即用50mu;l冷却的甲醇稀释以终止反应，然后储存在-80℃直至进一步分析。 分析前将样品解冻并以10,000rpm离心10分钟，通过HPLC检测完整二酯前药，再生单酯和母体药物GCV。 观察一级速率常数，并对照对照观察到的任何化学水解进行校正。

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2.4 细胞增殖测定

GCV前药的细胞毒性通过使用ARPE-19细胞的细胞增殖测定进一步评估。这种人RPE来源的细胞系已被广泛用作天然RPE的体外模型（Dunn等，1996）。为此目的使用细胞滴度96AQueousNon放射性细胞增殖测定试剂盒（Promega，Madison，WI）。在24孔至30孔的96孔板中接种ARPE-19细胞。在培养基中制备GCV和前体药物（10

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