将单克隆抗体PAb421微注射入人SW480结直肠癌细胞，可恢复p53突变体的转录激活功能外文翻译资料

 2022-08-11 10:23:57

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将单克隆抗体PAb421微注射入人SW480结直肠癌细胞，可恢复p53突变体的转录激活功能

Patricio AbarzAtilde;ordm;a,1 Joseph E. LoSardo, Mary Lou Gubler, and Anthony Neri

罗氏肿瘤研究中心，Hoffmann-LaRoche Inc.， Nutle， New Jerse 07110

摘要

p53抑癌基因是人类恶性肿瘤中经常发生突变的转录因子。肿瘤衍生的p53错义突变体在序列特异性DNA结合方面存在缺陷，不能激活p53靶基因，mAb PAb421在体外被证明可以恢复DNA与p53突变体的结合。在这里，我们展示了mAb PAb421当微注射到人SW480结直肠癌细胞中时，将转录激活功能恢复到常驻突变p53(其273的转录激活功能，pro的转录激活功能是ser 309)。273密码子是在人类肿瘤中发现的第二大p53错义突变体。我们的研究结果支持了将p53突变体的野生型功能恢复为一种癌症治疗策略的观点。

介绍

在人类恶性肿瘤中最常见的基因改变是p53基因的错义突变(1,2)具有肿瘤抑制作用的蛋白质。它在培养中抑制癌基因介导的细胞转化和抑制肿瘤来源细胞系的增殖(3-5)。在某些类型的细胞中，p53诱导程序化细胞死亡或凋亡(6,7).肿瘤基因转化细胞在生长信号冲突时发生p53介导的凋亡(8,9)。p53也介导传统DNA损伤衰老细胞毒性药物引起的细胞凋亡(10)。最近，体内肿瘤的发展和进展被证实受到p53依赖性凋亡的限制(11)。相比之下，肿瘤来源的p53突变体缺乏抑癌活性，也不表现出与野生型蛋白相关的任何生物学活性(3-5)。此外，p53突变体能够与RAS在原代培养的大鼠胚胎成纤维细胞的恶性转化中协同作用，这与核癌基因和病毒癌基因具有相同的性质(3,4,12)。

生化研究表明，野生型p53是一种序列特异性dna结合蛋白，可识别由2个5rsquo;-PuPuPuC(T/ a)(T/ a)GPyPyPy-3rsquo;(13-15)序列组成的20 bp motif。p53有效结合需要这两种共识的拷贝(14)。一个强酸性的转录激活域位于p53的氨基末端附近，在体内外均可刺激p53结合位点下游基因的表达(15-20)。与p53相关的序列特异性转录激活活性提示p53调控的基因介导了p53作为肿瘤抑制因子的生物学功能。已经发现了几个包含p53结合位点的基因，这些位点与p53 20-bp序列具有高度同源性。这些基因包括肌肉肌酸激酶、GADD45、MDM2、表皮生长因子、cyclin G和WAFi/Cipl基因(20-26)。有趣的是，最近发现的WAFI基因是一种强的周期蛋白依赖性激酶抑制剂，当它在肿瘤细胞中构成性表达时，显示出抑制细胞生长的作用，从而支持了它作为p53肿瘤抑制的重要介质的作用(24)。

p53的转录激活功能在自然发生的p53突变体中是有缺陷的(17-20)，已经被证明是其作为肿瘤细胞生长抑制因子的生物活性所必需的(27)。在大多数肿瘤中，p53突变体由于增加了稳定性而高表达。因此，恢复p53突变体的DNA结合和反活化功能是开发能够恢复p53功能和抑癌活性的治疗药物的一个有吸引力的策略。研究p53的DNA结合机制及其调控应该有助于更好地理解为什么突变蛋白对DNA的亲和力降低，以及逆转这一缺陷的可能途径。

p53特异的dna结合功能似乎受到位于氨基酸363和393之间的cooh -末端碱基区域的负调控。从Escherichia co//产生的野生型p53中删除或蛋白酶消化该区域，可以激活该蛋白的内在DNA结合能力(28)。同样，与p53结合后，其表位映射到370-378氨基酸的mAb PAb421也激活了DNA结合。这种效应是特异性的，因为与p53的nh2末端区域结合的单克隆抗体不会引起相同的反应(28)。我们还发现，当mAb PAb421与某些错义的p53突变体结合时，DNA结合得以恢复(29,30)，这表明一些p53突变体与DNA相互作用的亲和力降低，可以通过改变cooh -末端来纠正。

mAb PAb421被证明有能力恢复一些p53突变体的dna结合活性，这增加了一种可能性，即模拟抗体的分子可能恢复突变蛋白的肿瘤抑制活性。然而，所有这些研究都是在体外进行的;因此，尚不清楚在体内恢复DNA结合是否足以激活转录和抑制肿瘤。我们在这里报道了mAb PAb421微注射到SW480结直肠癌细胞中，恢复了常驻p53突变体的转录激活功能，从而证明了在体内恢复某些p53突变体的野生型功能的可行性。

材料和方法

质粒。野生型p53表达载体(pC53-SN3)是B. Vogelstein(约翰霍普金斯大学医学院，巴尔的摩，马里兰州;在这个质粒中，p53是由CMV2直接早期启动子表达的。构建beta;Gal记者质粒,细菌/ 3加基因和SV40聚腺苷酸化网站从pCHHO孤立Hindlll / BamHl片段克隆到Bluescript KS (BS / beta;Gal)。PG13 / beta;Gal记者从质粒是由克隆Hindlll片段PG13 /卢克,其中包含13份低聚糖PG和多瘤病毒启动子(18)到Hindlll BS / ayuml;gal。MG15 / ayuml;galreporter在类似的方式构造,包含15份低聚糖MG和多瘤病毒启动子(18)。瓦菲子被孤立为2.4 kb Hindlll片段的质粒WAFI-Luc(24)和克隆到b /个WAFl / beta;Gal beta;Gal让记者。

细胞提取物的制备及DNA结合实验。SW480细胞被镀在100毫米的盘子上，并在37°C的DMEM中生长到接近融合的温度，并添加了10%的胎牛血清。全细胞提取物在含20 mM Hepes (pH 7.9)、1 HIMDTT、1 mM EDTA、1 mM EGTA、0.4 M KC1、1 mM PMSF、1 /Ag/ml各含leupeptin、aprotinin、pepstatin和20%甘油的0.1 ml缓冲液中，经过3个循环的冷冻和解冻。提取物经14000 X g离心10分钟澄清，并储存于euro;“75A°C。用Bradford法测定蛋白浓度。用电泳迁移率移位法测定DNA结合活性。蛋白提取液与1 fxg poly(dl-dC)和0.5 ng mAb在室温下20 fil的结合缓冲液中预孵育30分钟[20 mM Hepes (pH 7.9)， 1 mM DTT, 50 mM KC1, 5 mM MgCl2, 10 /XMZnSO4, 0.1 mg/ml BSA, 0.1% NP40和5%甘油]。一个32p标记的双链寡核苷酸探针，包含一个非逆转录自退火共识p53结合位点(5- aggaagatct-GGACA-TGCCC-GGGCA-TGTCC-3)或WAF1 p53结合位点(5 aagtggatcc-GAACA-TGTCC-cAACA-TGTTg-3);加入底链5rsquo;-aggaagatct-cAACA-TGTTg-GGACA-TGTTC-3rsquo;)，室温孵育30 min。在预孵育步骤中加入竞争对手寡核苷酸。非特异性寡核苷酸竞争者含有来自人骨钙素基因的维生素D响应元件(顶链，5rsquo;-aagtggatcc-TTGGTGACTCAC CGGGTGAACGGGGGCATTG-3;底链,5“-aggaagatct-CAATGC-CCCCGTTCACCCGGTGAGTC-3”)。对寡核苷酸进行退火，用大肠杆菌DNA聚合酶I和dATP的Klenow片段、dGTP、TTP和dCTP(竞争对手)或[a32P]dCTP(放射性标记探针)填充5rsquo;overhang。将反应混合物装入5%聚丙烯酰胺凝胶中(80:1，聚丙烯酰胺:双聚丙烯酰胺)。凝胶在0.5 X TBE缓冲液(50 mM Tris-Borate (pH 8.3)-0.5 mMEDTA)中以200 V运行，室温90分钟。凝胶在真空下干燥，暴露在X射线胶片下。

显微镜下注射SW480细胞和beta;Gal染色。显微注射在尼康透热相衬倒置显微镜下进行，该显微镜配有Narishige四维液压微机械和尼康微注射器。针是由1.0毫米外径，90毫米硼硅酸盐毛细管，使用燃烧/棕色型微管拉出(Sutler仪器公司，Novato, CA)。毛细管在参数的作用下被拉伸，形成一个0.8-1.0-fj,m开口的针头。质粒和抗体分别在无Ca2 /Mg 的PBS中稀释，最终浓度分别为10aeuro;”200fig/ml和2-4 Mg /ml，通过a 0.22 /j。过滤后再装回针筒。SW480细胞(5 X IO5)被镀入60毫米的培养皿中，在含10%胎牛血清的DMEM中培养48小时。在微注射前，莱博维茨用含10%胎牛血清的L-15培养基代替培养基，以控制微注射过程中培养基的pH值。针被仔细地在细胞核上操作，大约10到100 fl的质粒在压力下被排出细胞核。大约40-80个细胞被注射在一个蚀刻的圆圈内，只有成功的核注射被计数。取去L-15培养基，代之以含10%胎牛血清的DMEM, 37A℃孵育24 h。细胞用PBS冲洗2次，2%多聚甲醛/0.2%戊二醛在4A℃固定5 min。PBS冲洗2次后，用X-gal染色液覆盖细胞[100 mMNaPO4 (pH 7.3)， 1.3 mM MgO2, 3 mM K3Fe(CN)6, 3 mM H4Fe(CN)6, 1 mg/ml X-gal]。在37A℃条件下显色，用低倍光学显微镜观察染色细胞。

结果与讨论

我们首先试图确定单克隆抗体PAb421是否能够恢复DNA与突变体p53的结合，该突变体是在活体中被选中并在其自然细胞环境中表达的。以往的研究表明，不同的p53突变体具有不同的生物学活性，可以通过组织或细胞类型特异性的方式在vivoin中被选择。我们选择了细胞系SW480结直肠癌患者,因为它符合两个标准也因为itexpresses p53突变(arg他273年)之前,证明在体外激活DNA结合PAb421和p53是第二个最常见的错义突变在人类癌症(29、30)。此外，来自SW480细胞的p53在氨基酸残基309 (参考文献31);因此，确定第二个氨基酸的变化是否会妨碍mAb PAb421恢复DNA结合是很重要的。

制备成指数生长的SW480细胞的全细胞提取物，通过电泳迁移率移位法检测其与p53的结合活性。我们使用了两种不同的双链寡核苷酸探针。第一个探针包含一个非回文一致的p53结合位点(14)，而第二个探针包含来自waf1基因的自然p53结合位点，它与两个核苷酸位置的一致位点不同(24)。当提取物SW480细胞孵化与这些探针,观察没有特定的乐队(图1)。增加马伯PAb421诱导appearanceof强有力的减速带的共识探针和弱带个WAFl探针。这个乐队不是p53-specific引发的马伯PAblSOl, p53的NHo-terminalregion结合,也被SV40 T抗原马伯PAb419(图1,通道2和3)。存在p53 PAb421 -诱导复杂进一步证实了乐队转移马伯PAblSOl(图1)。此外,复杂也转移了一个反老鼠免疫球蛋白(图1)。这些结果恶魔strate p53和PAb421都出现在这种蛋白质/ DNA复杂。竞争实验验证了pab421诱导复合物的特异性(图A, 9-12′，图IB, 9-14′)。只有含有p53结合位点的寡核苷酸才能有效地竞争形成这种阻滞带。因此，PAb421可以恢复p53突变体的序列特异性dna结合功能，该突变体是自然选择并在人类大肠癌细胞中表达的。我们的结果还表明，位于DNA结合核心区域(32)之外的p53的309密码子的突变并没有进一步显著损害序列特异性DNA结合。

证明激活PAb421导致修复的DNA结合转录激活p53基因突变的函数,我们microinjected ayuml;gal记者质粒和抗体SW480细胞,细胞化学的染色紧随其后。为了使实验成功，我们需要找到一个容易对p53产生反应但基础活性较低的报告质粒。我们在SW480细胞中通过瞬时转染法检测了两组质粒(数据未显示)。第一个质粒编码ayuml;gal基因由本机p53-responsive个WAFl启动子驱动的,而第二个质粒包含相同的报告基因由鼠标多瘤病毒启动子和基因的多聚体p53-binding网站从核糖体基因簇(PG13 / beta;Gal;。参考文献14 - 18)。转染个WAFl / beta;Gal记者导致一小部分细胞染色阳性beta;Gal。相比之下,我们未能发现任何染色细胞转染PG13 / beta;Gal质粒。SW480细胞转染野生型p53的两个质粒表达载体导致显著增加beta;Gal染色阳性细胞的数量。因此,PG13 /beta;Gal最初被选为基底活动以来的差事显微镜下注射试验在瞬时转染化验细胞化学的染色检测不到,但对野生型p53的存在反应强烈。作为一个消极的控制,我们用MG15 / beta;Gal质粒,其中包含突变型p53的多聚体结合位点和多瘤病毒启动子(18)。

将呈指数增长的SW480细胞直接与报告质粒DNA和野生型p53或mAb表达载体微注射入细胞核。24 h后,细胞被固定和染色beta;Gal活动。两个有代表性的实验结果如表1所示。数据规范化了显微镜下注射效率和细胞生存能力通过测量的分数染色细胞在显微镜下注射质粒CMV7 beta;Gal或RSV / beta;Gal。正如所料,显微镜下注射的野生型p53表达载体诱导beta;Gal活动从MG15 / beta;Gal pglvbeta;Gal但不是。同样,显微镜下注射马伯PAb421导致乳癌的一部分细胞表达beta;Gal PG13 / beta;Gal但却不是序列特异的转录激活函数MG15 /beta;Gal的性质。相比之下，p53 p53特异性单抗mAb PAblSOl和SV40 p53在SW480细胞中突变his 273。T抗原特异性mAb PAb

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