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硫酸盐还原菌与碳钢Q 235在生物膜中的相互作用
Cheng Sun, Jin Xu* and Fuhui Wang
国家重点实验室腐蚀与防护，金属研究所，中国中科院院士科学，沈阳110016，中国
Ind. Eng. Chem. Res., 2011, 50 (22), pp 12797–12806
DOI: 10.1021/ie200952y
Publication Date (Web): October 5, 2011
Copyright copy; 2011 American Chemical Society
E-mail: xujin@imr.ac.cn. Tel.: ( 86) 24 2391 5867. Fax: ( 86) 24 2391 5867.
摘要 本项目研究了硫酸盐还原菌(SRB)对碳钢腐蚀的影响，以及在土壤萃取液(SES)中SRB与碳钢q235的相互作用。结果表明，在SRB生长期，在有SRB的SES中Q235腐蚀速率较低，但在衰亡期腐蚀速率较大。采用扫描电镜(SEM)和能量色散x射线分析(EDXA)对SRB与钢的相互作用过程进行研究。SRB在无氧空间形成之前不会聚集在钢的表面。SRB通过吸收含有非游离氧的物质来抵御游离氧。
简介 自1892年Garrett发表第一篇关于金属微生物腐蚀的报告以来，在埋地管道、矿山、海港、湖泊、大坝、发电厂、污水处理系统、海上结构和油井中广泛发现金属微生物腐蚀(MIC)[1]。现已提出了硫酸盐还原菌(SRB)影响腐蚀的几种理论，如阴极去极化(15)、局部腐蚀细胞(16)、代谢物诱导腐蚀等(17)。SRB是土壤中最重要的厌氧腐蚀微生物(18)。SRB可以利用氢作为电子供体来获得能量，从而将氢分子从阴极中除去，导致金属表面的阴极去极化（19）。在代谢过程中，硫酸盐离子被还原为硫化物离子，与溶解的亚铁反应生成硫化铁(FeS)。硫化铁积聚在金属表面形成薄膜。最后，在硫化铁和未反应金属基体之间建立电偶联，加速铁的溶解(20-24)。Many research studies have focused on SRB-influenced corrosion of the metals and their alloys. Most of the reports show that SRB accelerated the corrosion of metals. Torres-Sanchez et al(25)。许多研究集中在SRB对金属及其合金的腐蚀。大多数报告表明SRB加速了金属的腐蚀。 Torres-Sanchez et al.(25)有报道指出，不锈钢AISI 304在SRB存在下形成高密度、低深度点蚀，腐蚀电位向更负方向进行转移。Lee等人(20)发现，一旦硫化铁颗粒接触到金属表面，在生物膜的存在下，低碳钢的腐蚀会增强。Sun等人(26,27)认为SRB会加速土壤锌的腐蚀速率。在相同电位下，灭菌土壤的阴极保护效率较高，平均腐蚀速率较低。Li等(28)的实验表明，随着SRB处于对数相，铜合金的腐蚀电位和极化电阻急剧向负方向移动。
然而，一些研究人员发现硫化物薄膜对金属有保护作用。(29-31) Syrett等(32-34)研究了铜镍合金在硫化物污染海水中的腐蚀行为。结果表明，即使允许pH值下降到7，硫化物的存在也不会引起合金的加速腐蚀。上述结果主要关注硫化物对培养液或海水中金属的保护作用，而对土壤环境中生物硫化物是否具有同样的保护作用的研究较少。本研究旨在进一步了解SRB对碳钢Q235在土壤中的腐蚀影响，以及SRB与钢之间的相互作用。
实验对象与方法
样品制备 从标称成分(wt%)为0.30 C、0.019 P、0.029 S、0.01 Si、0.42 Mn的碳钢Q235板上切取15times;15times;3mm试样，然后将其封入环氧树脂中，制备出表面暴露面积为2.25 cm2的试样进行电化学测量。样品上放置一系列砂纸(200、400、600和800)，用丙酮和酒精清洗干净，然后晾干。
土壤溶液的制备 本研究使用的土壤取自中国沈阳。土壤在105°C下干燥10小时，研磨，然后通过直径为1毫米的筛子摇匀。通过对土壤水/土比为5:1的土壤溶液进行过滤，制备了土壤萃取液(SES)。SES在121℃高压下蒸20 分钟, 4℃保存备用。
表1土壤成分(mg/kg土壤)
微生物 为研究Q235碳钢在土壤环境中的MIC，从土壤中分离了SRB菌株。在厌氧瓶中进行厌氧培养，培养基为含MgSO4·7H2O 0.2的API RP-38培养基(g/L)(35);
在厌氧瓶中进行厌氧培养，培养基为含MgSO4·7H2O 0.2的API RP-38培养基(g/L)(35);抗坏血酸1.0、NaCl 10.0、KH2PO4 0.5、乳酸钠4.0、酵母抽提液1.0、 Fe(NH4)2(SO4)2 0.02富集，用API RP-38培养基，通过无菌接种环取数个单菌落，在无菌琼脂平板中纯化。将黑色菌落立即放入含培养基的厌氧瓶中，在37℃恒温培养箱培养，在4℃环境下接种培养基，待培养基变黑后使用。
采用苯酚-氯仿法提取细菌基因组DNA。采用16S rDNA引物(27f: 5 #39; -AGAGTTTGATC[C/A]TGGCTCAG-3 #39;和1492r: 5 #39; -TACGG[A/T/C]TACCTTGTTACGACT T-3 #39;)扩增小亚单位基因编码rRNA。聚合酶链反应(PCR)进行50mu;L反应混合物，2mu;L DNA为模板，5mu;L 10times;PCR反应缓冲区，4mu;L deoxynucleoside三磷酸的浓度(核苷酸)2.5 mmol/L, 1mu;L底漆1的浓度20 pmol / L, 1mu;L底漆2的浓度20 pmol / L, 0.25mu;L Taq DNA聚合酶的浓度5 U·mu;/ L,以及36.75mu;L去离子水。PCR采用以下程序进行：94℃初始变性5min；94℃变性1 min;退火(55℃，1min)，延伸(72℃，3min)；最后一次延长(72°C, 8分钟)。PCR产物经琼脂糖(2%)凝胶电泳检测。纯化产物进行测序。得到16S rDNA序列比对序列，并将其用于Genbank初始BLAST搜索和系统发育分析。利用ClustaX构建系统发育树。初步鉴定该菌株为脱硫弧菌脱硫剂(DQ092636)，相似度为98%。
随后，将每个培养物的200毫升转移到800毫升无菌SES的单独混悬液中。磨损后的试样悬挂在含有SRB的介质中，置于密封的罐中(1000ml)进行腐蚀实验。SRB数是根据美国材料试验协会(ASTM)标准D 4412-84用三管多次最可能数(MPN)法测定的。
电化学阻抗谱(EIS)分析 利用电化学阻抗谱(EIS)研究了SRB浸泡在SES溶液中的腐蚀表面的电化学性能。所有实验均在三电极电化学电池中进行，以铂电极为对电极，饱和甘汞电极(SCE)为参比电极。实验采用EGamp;G公司生产的PARSTAT 2273电化学测量系统进行。频率范围从0.001 Hz到100 kHz，正弦电压信号的幅值为10 mV。利用PARSTAT2273提供的Zsimpwin软件对EIS数据进行建模和仿真。
SEM和EDXA分析
将试样分别浸泡2天、5天、10天、15天、20天后，用SRB从SES中提取试样进行显微分析。采用以下方法制备了碳钢Q235，并对其表面形貌进行观察。样本用3%戊二醛固定磷酸缓冲溶液(PBS, pH值7.3 - -7.4)大于4 h，然后用PBS洗了两个变化(5分钟)，用蒸馏水清洗一两个变化(5分钟)，并使用乙醇脱水梯度(50%,75%,95%和99%为10分钟)最后存储在干燥器中。采用扫描电子显微镜(XL30-FEG)对表面形貌进行观察，扫描电子显微镜的束流电压为25kv。
实验结果
SRB值和pH值的变化
图1显示了SES中SRB值和pH值随时间的变化。浮游SRB的数量在前6 h在SES中平稳波动，到第2天末急剧增加到30000 cfu/mL (cfu是集落形成单位)，10天后迅速下降到2 cfu/mL，然后保持稳定。SES的pH值在前2天随时间波动，后2天升高，10天后保持稳定。
EIS分析 图2和图3分别显示了添加SRB和不添加SRB时，碳钢q235随时间变化的EIS曲线。拟合结果如表2和表3所示，等效电路如图4所示。
表2 用SRB拟合SES中EIS的结果
表3 在没有SRB的SES中EIS的拟合结果
在电模拟电路中，Rs表示电解液电阻，Rf 和Qf分别表示薄膜的电阻和电容。Rt和 Qdl分别表示电荷转移电阻和双层电容。RL和L分别表示有源凹坑的电阻和电感电抗。
如图2和图3所示，用SRB在SES中得到的光谱在2天后有3个时间常数。频率最低的时间常数是由于活跃的凹坑的存在，使模型展现出典型的特征。(36)只有两个时间常数：第五天，二十天中观察到波德图，这表明，点蚀孔形成与早期积极坑扩张，并没有新的活跃坑出现。高频时的时间常数可能与生物膜的形成有关。
两天后，在没有SRB的情况下，SES只有一个时间常数。5天后出现低频感应回路，这是由于活性凹坑引起的。10天后观察到两个时间常数。高频时的时间常数可能是由于腐蚀产物膜的形成，而低频时的时间常数则是由于膜的不完善而出现的。
SEM和EDXA分析
从图5到图9可以看出，在加入SRB的SES中，碳钢Q235表面的微观形貌随时间的变化。
图5 2天后碳钢表面的微观形貌 图6 5天后碳钢表面的微观形貌
如图5所示，2天后观察到少量散在钢表面的鼓包状疏松产物。碳素钢表面没有固着SRB，但SES中有大量的浮游SRB(图1)。EDXA结果表明产物可能是磷化铁、(17)六磷酸铁、(38)或氧化铁，但没有观察到元素S。
如图6所示，5天后没有观察到大的絮球形状产物，但是有很多小的絮球形状产物，与第2天的产物不同，也比较松散。在松散产物下，观察到大量的固着SRB。浮游SRB的数量在第2天比第5天少(图1)。上述结果表明SRB更喜欢生活在产物和金属之间的无氧区域。EDXA结果表明，产物主要含有O、C、Fe等元素，可能为有机物，如胞外聚合物(EPS)、氧化铁等。上述结果表明，钢局部的表面形成了生物膜。
在碳钢表面的产物中没有发现P元素，这可能是因为含有P元素的化合物是在第二天形成的，当大量SRB聚集在钢表面时，这些化合物被其排斥在钢表面。
如图7所示，絮球形状的产物在10天后消失，在钢表面观察到一层致密的生物膜。致密膜在钢的局部表面已经开始脱落，SRB的数目减少。这表明，无论是浮游SRB还是固着SRB都处于濒死阶段。生物膜和SRB的活性在死亡阶段呈下降趋势，导致部分生物膜脱落。EDXA结果表明，生物膜表面存在元素S。
图7 10天后碳钢表面的微观形貌 图8 碳钢表面15天后的微观形貌
如图8所示，15天后，在产物的外层观察到一些新的絮球形状的产物。碳钢的整个表面几乎被两种不同的产物所覆盖，包括SRB代谢物和腐蚀产物。这两种产品是共生的。SES表面未发现SRB(图1)或碳钢(图8)。
EDXA结果表明，内层产物中含有P和S元素，说明这一层可能是生物膜。外层产物中未发现元素S。产品中存在少量Ca元素，这是由于随着SES pH值的增加，钙离子析出的原因(图1)。
图9为SRB存在15天后腐蚀产物中元素P和S的XPS结果。XPS分析表明，P和S化合物的主要成分为FeP3、FeS和FeS2
。
图9 XPS结果中，元素P和S在腐蚀 图10 20天后碳钢表面的微观形貌
产物中15天后出现的SRB
上述结果表明，随着生物膜活性和SRB数的降低，由于生物膜和SRB负电荷的损失，絮状产物在生物膜表面被重新吸收。(36、38)
如图10所示，碳钢表面被大量疏松的絮球状产物完全覆盖。
EDXA结果表明，腐蚀产物中没有S元素，且P元素和Ca元素的含量均大于15天后，表明含有P元素和Ca元素的化合物不断沉积在碳钢表面。图11为去除腐蚀产物后，碳钢Q235在添加SRB和不添加SRB的SES中的形貌。在有SRB的SES中，钢表面有明显的点蚀孔，而没有SRB时则没有。钢的表面在没有SRB的情况下仍然含有SES中的抛光槽。然而，这些沟槽已经消失在与SRB的SES。上述结果表明，钢的耐蚀性在有SRB的SES中明显高于无SRB的SES。钢在SRB存在下，表面容易发生点蚀。
图11 去除腐蚀后钢的表面形貌
SRB在腐蚀过程中的变化
图12和图13分别显示了碳钢表面在5天和10天后SRB的形貌。5天后Q235碳钢表面存在大量SRB，如图12所示，观察到SRB的两种形态:一种被许多球形物质包裹，另一种没有被包裹。EDXA结果表明，这些球形物质中含有Fe和O元素，表明SRB的外表面通过吸收氧化铁等腐蚀产物，保护自身免受游离氧等有害物质的侵害。
图12 5天后碳素钢表面SRB的形貌 图13 10天后碳素钢表面SRB的形貌
10天后钢表面仍可见SRB(图13)。生物膜有好几层，SRB生活在不同层之间。SRB没有被球形物质包裹，这可能是由于
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