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应用于现场十亿级的Aflatoxins定量比色分析的集成智能手机应用程序芯片系统
李晓春，范洋，黄晓春，华中宇
山西省太原工业大学物理与光电子学院先进传感器与智能控制系统重点实验室（教育部、山西省），山西省太原市，邮编：030024
西蒙·弗雷泽化学系加拿大不列颠哥伦比亚省伯纳比大学V5A 1S6
摘要：我们在此演示了一个集成的智能手机应用程序芯片（SPAC）系统，用于现场定量食品毒素，如aflatoxin B1 (AFB1)，在食品中含量为十亿分之一（ppb）。检测是基于在透明塑料芯片上借助微流体通道板进行间接竞争性免疫分析。安装在智能手机上的3D打印光学附件适用于校准分析芯片并为成像提供均匀照明，通过智能手机摄像头捕捉分析芯片的高质量图像，并使用定制开发的Android应用程序直接处理。利用加标和发霉的玉米样品对基于智能手机的检测系统的性能进行了测试，获得了与传统酶联免疫吸附测定（ELISA）试剂盒一致的结果。达到的检测限（3plusmn;1 ppb，相当于mu;g/kg）和动态响应范围（0.5minus;250 ppb）满足中国和北美当局规定的测试标准。我们设想，集成的SPAC系统将是一种简单、准确的食品毒素定量方法，为快速的现场筛选带来很大的好处。
曲霉毒素是由某些霉菌（黄曲霉和寄生曲霉）产生的一类有毒和致癌分子，通常在储存不当的食品（如辣椒、玉米、花生、大米和小麦）中发现。由于它们对人类和动物的健康有害，世界各地都发生了严重的食品安全问题，这是由于谷物和饲料中的一种aflatoxin污染。从2002年开始，这些食品毒素被国际癌症研究机构列为第一类致癌物；到目前为止，至少有14种aflatoxin被鉴定为主要的关注物种，包括aflatoxin B1 (AFB1)， B2 (AFB2)， G1 (AFG1)和 G2 (AFG2)。特别地，AFB1具有最高的毒性和致癌性；长期暴露于低浓度的AFB1可导致不利的免疫能力影响、生长和抗病性，而单一、高水平的暴露可导致人类和动物的急性肝炎和出血性坏死。正是出于这种考虑，大多数人的血液中都含有国家已经确定了AFB1的接触限值；在中国和美国，玉米和花生中AFB1的最大允许水平为20mu;g/kg（十亿分之一（ppb））。
为了检测和定量食品中的AFB1，建立了多种分析方法。传统的方法包括高效液相色谱法（HPLC）、6液相色谱-质谱法（LC-MS）、7和酶联免疫吸附测定法（ELISA）。这些技术具有较高的测试精度和灵敏度，但耗时长，需要经过培训的专业人员操作专用仪器。对于AFB1的现场筛选，金免疫色谱分析（如快速试纸）提供了一个低成本、快速和简单的检测方案。然而，这些快速试纸扫描只提供定性或半定量的结果；非常希望使用一种简单和便携式的方法来定量测定AFB1，以充分利用该方法满足食品安全监督的需要。
作为便携式荧光检测仪，像分光光度计一样的光学读数器已经开发多年，例如，使用量子点或纳米硅颗粒分析一系列物质，包括蛋白质、药物和毒素。近年来，技术不断发展，由于其强大的成像能力和开源应用程序开发环境，智能手机已被改造成新一代检测工具的操作。基于智能手机的分析技术也吸引了越来越多关于健康相关和食品安全监测方面的关注。例如，Coskun等人建立了一个食品过敏原检测平台，该平台具有专门设计的图像光学附件，并分析了在微孔中进行的免疫分析；使用智能手机摄像头获取分析的传输图像。Yu等人开发了一种一次性横向流动条，用于检测生奶中碱性磷酸酶的活性；在这种情况下，智能手机摄像头被用来监测金纳米粒子累积引起的颜色变化。Lee等人最近通过智能手机和LFIA阅读器对AFB1进行了单点横向流动免疫分析（LFIA）。
在这项工作中，我们展示了一个集成的智能手机应用程序芯片（SPAC）系统，用于在玉米样品中以十亿分之一（ppb）水平（相当于mu;g/kg）对AFB1进行定量；检测限的提高是基于透明塑料芯片上的银增强间接竞争免疫分析和定量显色法。使用定制设计的Android应用程序进行度量分析。我们还利用了成本效益高的光学附件，易于用3D打印机制作，为塑料芯片成像提供均匀的照明，并提高灰度读数的准确性。这项研究源于但不限于上述智能手机和配件作为强大分析设备的首创性适应。
实验部分
试剂和材料。从Sigma Aldrich（美国圣路易斯）购买了一种Aflatoxin B1minus;牛血清白蛋白（AFB1minus;BSA）结合物、小鼠单克隆抗AFB1抗体、AFB1标准品、吐温20、明胶、柠檬酸、N-羟基琥珀酰亚胺（NHS）和N-（3-（二甲胺基）丙基）-Nrsquo;-乙基碳化二亚胺盐酸盐（EDC）。牛血清白蛋白（BSA）、氯化钠（NaCl）、磷酸二氢钠（NaH2PO4）和磷酸氢二钠（Na2HPO4）购自阿拉丁（中国上海）。纳米金（直径1.4纳米）-链霉亲和素共轭物购自Nanoprobe公司（美国纽约），生物素标记试剂盒-NH2购自Dojindo实验室（日本熊本）。柠檬酸三钠、对苯二酚和硝酸银来自克美尔（中国天津）。Sylgard 184硅胶弹性体套件购自美国密歇根州米德兰市道康宁市。从拜耳（德国勒沃库森）公司购买了1.0 mm厚的透明聚碳酸酯（PC）板。商用AFB1酶联免疫吸附测定试剂盒购自中国镇江威士科技发展有限公司。
智能手机成像光学附件的制作。如图1a所示，光学附件的主要部件包括一个特殊光源和一个芯片槽（将塑料分析芯片固定在适当位置），该槽允许用智能手机直接对测试芯片成像（如图1b所示，华为荣耀3C、8MP照相机，f/2.0光圈和28mm焦距透镜）。该附件的框架是在Autodesk（Inventor）中设计的，并使用3D打印机（清心-M8）制作而成。如图1a右侧插图所示，16个白色发光二极管（LED，2times;3times;4 mm）组装在导光板（LGP，51times;51times;4 mm，阴极）的边缘，该导光板位于反射板（51times;51times;1 mm，阴极）下方和双用户（53times;53times;1.5 mm，阴极）上方。LGP由聚甲基丙烯酸甲酯（PMMA）制成，顶部印有设计的散射点图案。附件的顶部是一个电池室（带开关），里面装有两个AAA电池（1.5 V），为LED灯提供电源。图1b显示了塑料分析芯片是如何在智能手机上用光学附件成像的。在这种情况下，附件是颠倒的，这使得用户能够方便地进行图像采集和后续分析。
图1（a）智能手机芯片成像光学附件结构示意图（b）使用安装了光学附件和定制应用程序的智能手机操作芯片成像和数据处理
Android应用程序，用于智能手机芯片成像和分析。使用Android开发工具进行Java编译，用于成像和分析测试芯片的一个定制的应用程序名为AFB1DET。它是在运行Android 4.4.2的华为智能手机上安装和测试的。除了芯片成像，数据分析也可以用同一个应用程序进行，即直接处理捕获的图像，测试结果显示在智能手机屏幕上。该“AFB1DET”应用程序的总体工作流程如下（图2）：（a）“AFB1DET”应用程序在用户点击AFB1DET图标后开始在智能手机上运行。主界面显示三个供用户选择的选项：新测试、历史记录和指令（图2a）。（b）当选择新的测试时，智能手机的后摄像头打开，屏幕上显示带有红色框的预览。它被设计为显示11个信号红色条和3个背景蓝色条，所有这些都在用户与分析条对齐的红色框中。当用户选择“捕获”功能时，相机将获取分析芯片感兴趣区域（ROI）的图像。图像随后被转换成灰度图像并存储在智能手机的内存中。（c）为了获得关于试验的定量信息，用户可以选择“分析”选项；然后通过应用程序分析捕获的图像和试验结果；即，未知样品中AFB1的计算浓度立即显示在屏幕上（图2c）。
图2 安卓智能手机上运行的“AFB1DET”应用程序截图（a）带有用户选项的主菜单（b）在塑料分析芯片屏幕上预览。用户使用屏幕上的对齐辅助工具对齐分析条，并选择捕获功能以获取图像。（c）将捕获图像的数据分析结果显示给用户
手机相机拍摄的图像通常显示在RGB（红色、绿色、蓝色）颜色空间中；但是，灰度模式需要根据亮度值（灰度强度）来量化信号。因此，根据将RGB像素强度转换为灰度强度的一般表达式，编写了将每个像素从RGB转换为灰度的应用程序。
其中R（红色）、G（绿色）和B（蓝色）是各自颜色通道中的像素强度，I是灰度强度。我们采用光学暗度比（ODR）作为定量测量方法来分析每个条带的信号强度，由下给出。
其中是背景的灰度值，是测试条的灰度值。在这里，我们将试片定义为PDMS通道板的测试区域，将背景定义为通道之间的区域。使用条带周围的矩形区域（9times;260像素）计算每条条带的平均灰度值，使用条带之间的三个矩形区域（23times;260像素）计算背景的平均灰度值。每条带的ODR由式2得出。根据AFB1标准溶液的浓度和相应的ODR值，用最小二乘法计算了校准方程及其相关系数。根据校准方程和获得的ODR值，我们随后测定了各种样品中AFB1的浓度（如下所述）。
塑料切片的表面活化和分析制备。首先用乙醇清洁PC板，然后在紫外线/臭氧清洁剂（PSD-UV，Novascan Technologies Inc.，Ames，USA）中处理30分钟，以产生具有高密度羧酸基团的亲水表面。随后将芯片浸入0.1 m磷酸盐缓冲液中，pH6.0，其中含有5.0mM EDC和0.3mM NHS，浸泡5 h以激活表面的羧酸基团，随后用去离子水冲洗并在氮气流下干燥。
将一块嵌有微通道（0.5 m mtimes;25 m mtimes;50mu;m）的PDMS（聚二甲基硅氧烷）板（48 m mtimes;50 m mtimes;1 m m）直接放置在活性PC板（55 m mtimes;65 m mtimes;1 m m）的表面上，并将其密封在一起，通过将PDMS板轻轻压到PC板上防止溶液泄漏（图3）。在每个通道端部的PDMS上打两个孔作为入口和出口；使用微量移液管将溶液注入入口，并通过毛细管作用将溶液吸入出口。通过抽吸（例如使用微量移液管）从出液口去除溶液。为了进行分析，将含有AFB1minus;BSA共轭物（400mu;g/ml）的20 mM磷酸盐缓冲液（pH7.4，150 mM NaCl）注入每个通道，并在室温下保持过夜，然后在20 mM磷酸盐缓冲液（pH7.4，150 mM NaCl）中用4%BSA处理3h，使每个通道的表面钝化。
对于样品测试，将1mu;l生物素化抗FB1抗体（22mu;g/ml）与标准品1mu;l AFB1标准溶液（浓度范围为0至500 ng/ml）或1mu;l未知玉米样品（如下所述制备）的混合物分别按顺序注入每个通道并培养30分钟。用20 mM磷酸盐缓冲液冲洗通道，然后在20 mM磷酸盐缓冲液（pH7.4、150 mM NaCl、0.1%BSA和0.05%NaN3）中注入纳米金-链霉素共轭溶液，并培养25分钟。然后取出PDMS板，用去离子水彻底清洗塑料分析芯片，干燥。随后将其浸入新制的银染色溶液（48 mM硝酸银和192 mM对苯二酚）中5分钟，以放大信号。最后，用去离子水彻底清洗芯片以停止反应；成像前在氮气下干燥。
用酶联免疫吸附试验和高效液相色谱法进行真实样品制备和验证试验。除测试AFB1标准溶液外，还测试了添加新鲜和发霉的玉米样品；后者是通过在潮湿环境中在室温下培育新鲜玉米1周以促进霉菌生长而获得的。在这两种情况下，将玉米样品磨成细粉（研钵和研杵）。用含有4%Nacl的甲醇-水（7:3，v/v）和剧烈摇动2分钟来提取风味毒素。对于加标样品（0、5、10、25 ng/ml），向混合物中添加AFB1标准，搅拌2分钟，并在使用0.5 ml甲醇-水重新悬浮混合物之前干燥过夜。然后对样品进行在877g（Zonkia离心机HC-2518转速为3500转/分）下离心5分钟；用去离子水将上清液的小份稀释一半，用于用SPAC系统或酶联免疫吸附试验的样品。离心后，用高效液相色谱法对待试验的提取物进行过滤；首先用Whatman 4级过滤纸对样品进行过滤。用等量的去离子水稀释，然后通过玻璃微过滤器，进一步用流速为6 ml/min的Isolute多模SPE柱萃取。用20 ml（2times;10 ml）水洗涤柱，然后用空气干燥。以1-2 ml/min的流速将1 ml甲醇通过柱洗脱AFB1。在氮气流下将洗脱液蒸发至45°C干燥，并用1 ml LC流动相溶液重新溶解残余物（用于HPLC试验）。
为了验证所开发的SPAC系统的准确性，根据制造商的对比研究说明，使用了商用AFB1酶联免疫吸附测定试剂盒。按照顺序将布里料、不同浓度的AFB1或加标玉米样品（50mu;l/孔）、抗AFB1抗体和抗rabbit-HRP添加到孔中，并在室温下培养30分钟。将酶联免疫吸附测定板清洗4次，每孔加入100mu;l TMB溶液，25℃孵育15分钟，然后加入停止液（2 M H2SO4，50mu;l/孔）。使用多扫描-去-微板分光光度计（美国沃尔瑟姆Thermo-Fisher-Scienti-fic）测量450 nm处的吸光度。
使用日本东京岛津高效液相色谱系统（LC-20AD）和荧光检测器分析标准样品和玉米样品。在反相垫片组FC-ODS分析柱（75times;4.6 mm）上进行色谱分离。注入量为10mu;l，柱温保持在40°C。流动相为水-甲醇（55 45）溶液，流速为0.8 ml/min。为了增强AFB1的荧光反应，在高效液相色谱系统的CRB-6a中，以0.2 ml/min的碘溶液0.05%进行在线和柱后衍生。荧光检测器的激发波长和发射波长分别设置为360和440纳米。一个循环的运行时间为10分钟，AFB1在这些条件下的保持时间约为6.9分钟。
结果和讨论
基于芯片的竞争分析设计与优化。在透明塑料板上使用预先固定的AFB1-牛血清白蛋白（BSA）结合物在目标物（游离AFB1）存在下捕获标记抗体，进行间接竞争性免疫分析以检测AFB1（图3）。如图3所示，探针分子AFB1-BSA共轭物在微流体通道板的辅助下通过表面耦合排列在PC芯片的表面上。引入含有样品和生物素化抗AFB1抗体的混合物后，自由AFB1（样品中）和固定探针（AFB1minus;BSA结合物）与抗体发生竞争性识别反应；自由抗体和与自由AFB1结合的抗体被冲走。由于生物素-链霉亲和素的强相互作用，添加的纳米金-链霉亲和素缀合物随后与生物素化抗体结合
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资料编号：[2704]
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