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土地利用类型转变对荒漠源土壤微生物群落的影响
摘要：
土壤在微生物门的分类水平上具有相对稳定的细菌群落。然而，没有两种土壤具有完全相同的细菌门结构。微生物群落结构受土地利用类型的强烈影响，土壤属性的变化决定了微生物群落的结构。利用高通量焦磷酸测序和定量聚合酶链反应技术，对土地利用梯度为100~27年的农田、33年的松林、28年的杨树林和21年的灌木林，以及所有耕作系统转换的原始沙漠土壤微生物群落结构进行了研究。结果表明，土壤中的优势菌群主要由alpha;-变形菌、放线菌、拟杆菌和厚壁菌组成，占细菌16S rRNA序列的gt;71.4%。土地利用的变化导致这些优势菌群显著减少，降至33.4%。而低丰度菌群，如酸杆菌、绿弯菌、硝化螺菌和gamma;-变形菌，在全部16S rRNA基因序列中则从原始土壤中的4.5%~5.9%急剧增加到除灌木林外所有耕作土壤的20.9%~30.2%。细菌主要类群的这些对比变化似乎与土壤属性的变化有关。例如，在100年的农田土壤中，细菌和古菌的amoA基因比原始土壤丰富了960倍和3800倍。土壤无机氮动态变化与土壤中数量较少的不占优势的硝化菌群的变化基本一致。16S rRNA基因的定量研究表明，细菌和古菌在栽培土壤中的数量比本地土壤多2~3个数量级。因此，土地利用类型影响土壤细菌群落结构，对生态系统功能产生深远影响。
关键词：amoA，生态系统功能，土地利用类型，聚合酶链式反应，焦磷酸测序。
引言
微生物是土壤中数量最多、种类最丰富的一类生物，在土壤生物地球化学过程中发挥着重要作用，包括养分循环、大气固氮、有机物质和污染物的分解等。没有两种土壤的细菌组成完全相同，尽管在不同土地利用类型下的土壤有大约9个主要细菌门组成的相对稳定的群落(Janssen，2006年)。土壤微生物群落组成可能受到当代特定地点的环境条件的强烈影响，例如土壤含水量(Schimel等人，1999年；Bachar等人，2010年)、碳供应(Fierer等人，2007年)、pH(Fierer和Jackson，2006年；Lauber等人，2009年；Chu等人，2010年)和盐度(Fierer和Jackson，2006年；Lozupone和Knight，2007年)。人为活动，如毁林和农业，可能通过改变土壤特性在调节土壤细菌群落结构方面发挥重要作用。因此，确定不同的土地利用类型对土壤细菌群落的影响是改善生态系统服务和土壤功能的重要组成部分。
原生土壤转化为功能不同的生态系统可以提供一个理想的模型来描述土壤主要微生物谱系的结构模式，以响应人类活动随着时间的推移。土地利用变化对微生物群落结构的影响已被广泛研究（巴克利和施密特，2001；博新奥et al.，2005；Acosta沃尔玛acute;ı牛鼻et al.，2008；大C Jesus et al.，2009）。然而，人类活动如何塑造土壤微生物群落仍然是难以捉摸的。其原因可能是由于单一生态系统内土地利用的频繁变化和/或缺乏所有土地利用类型转变的参考土壤。本研究所采用的人工绿洲交错带是一个生态样带，由至少5个功能不同的生态系统组成，它们来自同一沙漠土壤。因此，本实验区主要研究了中国西北部地区人为活动对微生物群落结构的影响及其随时间的变化。
方法的局限曾限制微生物功能类群的深入研究，虽然它们在生态系统的运作中起着重要作用。例如，氨氧化是全球氮循环的关键步骤，由氨氧化细菌(AOB)和古菌(AOA)催化。然而，AOB只占整个微生物群落的一小部分，而且以缓慢生长而闻名(leininger等人，2006年)。下一代测序技术的迅速发展，如454技术，使得在整体群落水平解析AOA和AOB的结构变得前所未有的容易(Roesch等人，2007年)。表征硝化微生物的群落结构适用于研究施用铵肥的农田生态系统功能。功能微生物类群相对丰度的潜在变化可能有助于深入了解微生物群落结构与生态系统功能之间的关系。
本研究采用条形码焦磷酸测序方法，对100年和27年农田、33年松林、28年杨树林、21年灌木林和原始荒漠的土壤细菌群落结构进行了研究，以上所有栽培土壤都是由荒漠土发育而来(Yang等人，2008年)。为了防止绿洲农业生态系统的土壤侵蚀和荒漠化，通常在绿洲和沙漠系统之间开发森林防护林，以产生不同土地利用类型的典型梯度(SU等人，2007年)。除灌木林外，所有栽培生态系统都进行年度灌溉。除总微生物群落16S rRNA基因丰度外，本研究还通过分析编码氨单加氧酶A亚基的Amoa基因的丰度，定量了土壤AOB和AOA的丰度。
材料和方法
场地描述和土壤取样
研究地点(39°19′ 23.2Prime;~39° 22′ 1.9Prime; N，100° 08′49.8Prime;~100° 9′33.2Prime; E)位于中国甘肃省黑河沿岸中国生态系统研究网临泽内河流域研究站附近(图1)。黑河流域是我国西北地区第二大内陆干旱区。它占地约130000平方公里，夹在南祁连山和马宗山北部之间(Li等人，2001年)。该地区有温带大陆气候，年平均降水量约为117毫米，其中超过70%的降雨量发生在6月至9月之间的夏季。平均年温度为7.6摄氏度，1月的最低气温为-10.7摄氏度，7月份的最高气温为23.8摄氏度(Liu等人，2010年)。土壤质地是沙质和沙质壤土(Lu等人，2003年)。
采集了六种不同土地利用类型的土壤样本，包括100年的农田、27年的农田、33年的松林、28年的杨树林、21年的灌木林和原始的沙漠(图1)。这种具有独特生态系统功能的土地利用梯度在中国西北地区是典型的，它包括约二百六十四万平方公里的沙漠面积，占全国领土的27.5%(Yang等人，2008年)。玉米和小麦在100年和27年的农田上轮作。所有的耕地都是由沙漠土壤发育而来。土壤样品是从每种土地利用类型的三个生物学重复小区采集。在直径200~500 m的圆圈内，随机抽取0~20 cm的3个子样。每个小区的土壤样品均质化，储存在-20℃待用。
Fig. 1 Satellite image of the research site containing an ecological gradient of six different land-use types (a) and the schematic outlines of sampling points with three biological replicates (b).
DNA提取与实时定量聚合酶链反应
土壤DNA提取方法参考先前描述并稍作修改（Jia和Conrad，2009），每个土壤提取三个重复。土壤样品的DNA提取一式三份，操作步骤如下所述。取大约0.5到0.7克新鲜土壤（相当于0.5克干土），加入1.25毫升十六烷基三甲基溴化铵（CTAB）缓冲液（0.1 mol/ L的NaCl，13.6 mmol/L磷酸二氢钠，186.4 mmol/L Na2HPO4、20 g/L CTAB法、50 mmol/L EDTANa2）的混合物，再与0.5克的0.1毫米直径的玻璃珠和0.5克的0.6毫米直径的玻璃珠混合。在液氮中冷冻10分钟，再在65℃中解冻30 min，重复三次，使土壤微生物DNA从细胞中释放出来。土壤样品在fastprep破碎仪（qbiogene公司，Illkirch，法国）中以6m/s震荡 45秒。置冰上冷却1分钟后，将被破坏的土壤样品在4℃，以10000times;g离心5分钟，转移上清液到一个新的2毫升管。剩余的土壤颗粒再提取两次以对土壤微生物多样性充分评估（Feinstein et al.，2009）。用等体积的酚-氯仿-异戊醇溶液（25:24:1，v/v/v）和氯仿异戊醇溶液（24:1，v/v）连续进行DNA的提取和纯化。离心后，水相与聚乙二醇（PEG）沉淀剂（200 g Lminus;1 PEG-6000和2.5 mol Lminus;1 NaCl）等体积混合，在37℃孵育1 h。 混合物在18℃下以16000times;g离心30分钟获取 DNA沉淀。土壤DNA沉淀使用500 micro;L 70%预冷乙醇清洗两次，置空气中干燥，最终溶解在在100 micro;L TE（Tris-EDTA缓冲液）中。将三次连续提取的DNA沉淀混合，保存在-20℃待用。土壤DNA提取液稀释10倍后，用Nanodrop ND-1000紫外可见分光光度计（NanoDrop技术，威尔明顿，美国）测定DNA 样品的浓度和纯度，，用于后续分子分析。
用引物515F-907R (Angenent等人，2005年)和771F-934R(Grobeta;Kopf等人，1998年；Ochsenreiter等人，2003年) 分别对细菌和古菌的总丰度进行定量分析，定量PCR反应在CFX 96实时定量PCR扩增仪上进行(Bio-Rad实验室，Inc.，Hercules，美国)。此外，对AOB和AOA的amoA基因进行了量化，方法参见先前报道(贾和Conrad，2009年)。聚合酶链式反应(PCR)条件和引物见表一。定量PCR 标线采用含有目的基因的大肠杆菌进行克隆制备。克隆子在含100 mu;g mL-1氨苄西林的LB培养基中，37℃培养约12h。用Takara MiniBEST质粒纯化试剂盒(Takara，大连，中国大连)提取和纯化质粒DNA，并用NanoDrop ND-1000紫外可见分光光度计(NanoDrop Technologies，Wilmington，USA)对其进行定量。质粒DNA连续稀释6~8个数量级，建立实时定量PCR标准曲线。以水代替土壤DNA为模板作为定量PCR反应的阴性对照。PCR反应体系总体积为20 mu;L：10 mu;L SYBR预混剂ExTaqTM(大连)、0.5 mu;mol L-1引物和1 mu;L PCR模板DNA(约1~8 ng)。，反应体系经1%琼脂糖凝胶电泳分析和熔融曲线分析，证实特异扩增为单峰。不同基因的实时定量PCR反应均包含三个生物学重复，每个生物学重复又包含3个技术性重复。扩增效率为98.5%~102%，R2值为0.990~0.998。
焦磷酸测序和数据分析
每个站点采集3个生物学重复土壤样品，并进行匀浆，并按上述方法提取DNA。如前所述，进行了焦磷酸测序(夏等人，2011年)。简单地说，用515F-907R法扩增了DNA提取物(Angenent等人，2005年)。每个样本都用独特的条形码引物标记(数据未显示)。PCR反应为25 mu;L混合体系：引物0.5 mu;L， 引物浓度为30 mu;mol L-1，1.5 mu;L模板DNA，22.5 mu;L Platinum PCR SuperMix (Invitrogen，上海)。热程序为：94℃，3 min；（94℃，45 s；55℃，30 s；72℃，90 s），重复35个循环；72℃6 min。所有样品一式三份。用灭菌水代替土壤DNA提取液作为阴性对照，检查引物或样本DNA污染情况。采用凝胶纯化法对技术上的三份扩增产物进行混合纯化，并用Picogreen(Invitrogen，中国上海)进行定量分析。将不同样品的PCR产物按等摩尔比混合成单管，为焦磷酸测序分析做准备。454焦测序所需的A和B端接头按照先前描述的方法添加到扩增的16S rRNA基因片段的特定末端(Roesch等人，2007年)。在中国科学院青岛生物能源与生物加工技术研究所生物能源基因组中心的454生命科学GS FLX钛测序仪上进行了焦磷酸测序。序列最终上传至DDBJ(日本DNA数据库)， 序列号DRA 000315。
使用核糖体数据库项目(RDP)焦磷酸测序通道(http：//py.cme.msu.edu/)对16S rRNA基因序列进行处理(Cole等人，2009年)。在初始处理步骤中，根据样本特殊标记序列(条形码)从多个样本中读取每个样品的原始序列。然后使用RDP焦磷酸测序通道对每个样本的序列进行裁剪。在随后的分析中，只保留长度大于200 bp的序列，平均质量分数gt;25，没有模糊碱基的序列(Huse等人，2007年)。每个样本的序列都使用快速二级结构感知Infernal aligner进行对准(Nawrocki和Eddy，2007)。然后，使用完全连锁聚类算法的自定义代码，在多个成对距离上将序列聚类到不同操作分类单元(OTU)中。在不同的序列相异度水平上，通过绘制观察到的OTUs数和采样序列数，生成稀疏曲线。利用RDP Classier确定了各分类单元的的系统分类特征。以Greengenes数据库(Deantis等人，2006年)为目标数据库，通过Mothur(Schlos等人，2009年)估算了ACE和Chao 1(Chao和Bunge，2002年)的多样性指数。
成对样本之间的总体群落组成差异以系统进化树为依据，通过使用FastUnifrac的主坐标分析(PCoA)函数获得未加权(即只考虑是否存在分类群)和加权算法(即考虑到分类群的相对丰度)(Lozupone和Knight，2005年；Lozupone等人，2006年)的系统发育树。FastUniFrac通过量化系统进化树状图中特定分支长度和总分支长度之间的比例来估计成对样品群落之间的系统发育距离。
采用典型对应分析法(CCA)研究了土壤细菌类群与土壤水分、土壤pH、有机碳、水溶性C、全N、盐、NH4 -N和NO3-
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