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叶绿素荧光分析：良好实践并理解其新应用的指南
摘要：叶绿素荧光是对光系统 II（PSII）活性的非侵入性测量，并且是常用的植物生理学技术。 PSII 活性对非生物和生物因子的敏感性使其成为关键技术这不仅是为了解光合机制，而且也是植物如何响应的一个更广泛的指标环境变化。这以及低成本和便于收集数据的特点，形成了一个大的外观，用于测量的仪器类型阵列和计算出的参数可能令新用户感到困惑。此外，它的可接近性可能曲解其中的光合作用过程。这次研究是及时的，因为它对叶绿素荧光重新产生兴趣现在需要对作物改良目的进行光合作用的快速测量。这里我们帮助研究人员根据使用可用设备和专业知识的协议进行选择，特别是用于现场测量。我们从荧光分析原理的基本概述开始提供建议在进行脉冲幅度调制测量的最佳实践中，我们还讨论了一些当代作物和生态学研究的新兴技术，我们不断开发和应用分析技术来应对近年来出现的新挑战，我们通过简要讨论结束研究。通过监测荧光，叶绿素荧光成像，田间表型分析和农作物遥感以提高产量和提高生物量的新兴领域。
研究目的
叶绿素荧光是植物生理学中最受欢迎的技术之一，因为它易于使用，用户可以以相对低的成本获得有关系统 II（PSII）状态的详细信息。通过它能理解它在光合作用的基本机制中的作用，植物对环境变化的反应，遗传变异和生态多样性。这个的目的是制定对叶绿素荧光分析的良好实践指南，并介绍一些新兴技术和新技术应用。虽然我们会提供一个简要的概述并解释叶绿素荧光的原理，但我们不提供对技术本身的深入研究测量背后的理论，并且我们引用读者对此进行的详细评论。
最近人们对使用叶绿素的兴趣增加了不少，荧光技术主要是研究在作物改良方面特别是在筛选方面，理想的植物性状和连接基因组信息具有物候响应，因此对快速筛选光合作用的方案有关植物状态的高分辨率信息（通常是与植物生长/发育参数有关和产量或压力有很大需求，以及在短时间内需要测量大量地方。可以选择参数从荧光数据结合可用的仪器的多样性计算，这其中使用的协议和参数至关重要测量适用于特定的个人研究以及研究问题，以确保有效收集数据并得出正确的结论。用户面临一系列选项，包括类型测量平台，仪器设置，黑暗适应期的时间安排，以及在何种条件下测量植物。如果没有经验可能导致数据并没有完全测量出来，或正在测试或假设的假设没有充分表现覆盖植物表型的范围。
在这次研究中，我们认识到其使用的要求，这项技术在生态和农业和农业领域的应用，特别是在必须快速测量的情况下，此外，开发新的设备，如监测荧光光谱用于长期自动评估光合作用和叶绿素荧光成像为表型筛选提供了新的机会。
什么是叶绿素荧光？
叶片内的叶绿素以 PSII，PSI 中的色素蛋白质复合物的形式存在，并且这些反应中的每一个相关的光捕获复合物（LHC）内存在中心。叶绿素分子吸收的光能可以（i）驱动光合作用（光化学）; （ii）重新排放作为热量;或（iii）以光（荧光）重新发射（图 1）。这三个过程不是孤立存在的，而是相辅相成的。因此，氯化镓荧光发射的收率为我们提供了有价值的信息，即关于光化学和热量子效率耗散。这对植物的光合作用和植物很重要。因为光化学最终被用于产能为二氧化碳同化提供能源和减少能源。在室温下，我们假定荧光信号的变化仅来自 PSII，我们忽略来自 PSI 的信号发射，主要是因为信号在 700nm 以下不会产生显着的效果。由于叶绿素荧光是重新发射光的量度，（在红色波段）来自 PSII，这一点自然就意味着任何环境的光都会干扰荧光的测量，因此很多早期的系统必须设置在在黑暗和/或高度控制的光环境中。这个问题后来被发展出的调制系统的所解决，这个系统以其用于诱导荧光的光（测量光束）以已知频率施加（调制），并且把探测器设置为以相同的频率进行测量。以这种方式，检测器将仅测量由测量光束激发产生的荧光并且不会受到环境光线的干扰。这样做的好处是可以无需在使叶子变黑后进行测量。近来人们对未调制荧光重新产生兴趣，它提供了在黑暗中对一些参数的测量，例如通过分析荧光诱导在施加 1s 脉冲期间发生的瞬态。使用小型手持式设备基于荧光进行筛选，其中关键的测量可以做到非常准确和快速。目前有很多基于物理研究的参数 PSII 声称提供详细的结构和功能有关 PSII 活动，天线尺寸和电子的信息运输。这是一项敏感的技术，并正在获得用于作物表型分析的支持简单的参数。但是，对更复杂参数的经验的持续缺乏不能使其解释合理，我们敦促谨慎，这个是与提供声音的大量数据形成对比调制技术的生理框架。在这研究中，我们只有能力涉及对调制荧光色度的分析。
叶绿素荧光原理分析
本节介绍在与叶绿素荧光分析下相关的类囊体膜内发生的生化反应。旨在帮助读
者理解原理，同时详细说明下一部分给出的参数的解释。我们关键通过还原和氧
化（氧化还原）状态理解反应，电子载体对叶绿素荧光的变化很重要，如图 1 所
示。当光照足以驱动光照期后，在经过一段时间的黑暗后，叶片上会有一束光瞬
时升高（通常为几秒），通常是类囊体膜中的电子载体减少的结果所造成的，在
特殊 PSI 中的叶绿素 P680 会喷出水中的电子分裂成电子受体 QA（结合醌）通过
最初的受体脱镁叶绿素。但是，QA 无法接受来自 P680 的另一个电子直到它已
经通过它的电子脉冲串到达下一个载波 QB。在这种状态下，反应中心是被认为
是“关闭”的。在一般情况下，光照强度或温度（影响代谢状态）的比例或多或少
都可能使反应中心关闭。反应中心的关闭将不可避免地导致 PSII 的量子效率衰
退。
图1。对PSII中事件的简化描述，导致荧光分析中关键参数的识别。（a）一个示意图 图显示PSII反应中心复合体内的电子输运。采光中叶绿素吸收的能量络合物可以通过光化学、热（非光化学淬灭）或荧光消散。之间的竞争这些过程使我们能够解决PSII的效率。（b）在暗适应的叶材料上显示的典型的荧光痕迹。如何形成FO和FM。测量光束激发叶绿素，但没有足够的强度诱导电子传输。 通过PSII（即当Pheo减少时的电荷分离）。这给出了FO、最小的荧光水平和反应中心。说是开着的。光的短暂饱和脉冲导致荧光的最大可能产量FM的形成。在此期间有效地关闭脉冲反应中心。（c）解释PSII内能量和电子转移的示意图 在开放和封闭的中心和FO和FM状态的形成，分别。激发态P680*及其后续转移 电子到初级受体QA会产生一个封闭的中心。质量保证不能接受另一个电子，直到它的电子通过下一个电子受体，QB。
在应用光化光，荧光的初始值上升之后，荧光信号随后下降的几分钟内的这一过程，被称为“淬火”。荧光信号的猝灭可由该过程的组合引起。首先是光合作用本身的光激活。特别是，加尔文循环中的关键酶需要激活才能实现完全活性(Buchanan and Balmer,2005) ,基质和胞浆中的代谢物池大小需要增加。从黑暗的环境温度，这个过程通常需要几分钟或更长时间，物种和环境造成了大量的变异。另一个因素是气孔的开放。增加Rubisco的CO2可用性。气孔倾向打开和关闭一个数量级比慢光合事件。所有这些过程提供了用于下沉的可用性的增加。源自光相关过程的电子 类囊体及其对淬火过程的贡献 光合作用本身，这叫做光化学。淬火。其次，在照明方面，有快速增长。 叶绿素的热耗散速率常数激励能量，用一个称为参数的参数来测量非光化学淬灭（NPQ）。这是一种去除多余激发能的光保护过程。在含叶绿素的配合物中并防止破坏性自由基形成的可能性。这个 荧光猝灭与荧光猝灭的竞争类型光化学猝灭，作为“安全”机制消散大量叶绿素激发水平 能源，取决于当时的条件和物种。(Demmig-Adams and Adams, 2006)。NPQ的过程是 由于类囊体腔的酸化而引起的类囊体腔中质子的积累（期间）形成一个delta;pH的线性和循环电子流 (Horton et al., 1996, 2008; Ruban et al., 2012)。它也涉及到叶黄素循环中调节蛋白PSBS与堇菜黄素对玉米黄素的转化(Li et al., 2002; Kiss et al., 2008; Murchie and Niyogi, 2011)。叶黄素是在NPQ中起关键作用的类胡萝卜素 (Demmig Adams, 1990)紫堇黄素向玉米黄质的转化是在活化后的光下进行的。酸化作用下的酶-紫黄质脱环氧酶类囊体腔(Yamamoto et al., 1999).PSBS的质子化和玉米黄质的形成诱导PSII天线构象变化的研究PSII天线激发能的猝灭
(Ruban et al., 2012)。分析允许我们分离组成的组成部分。类囊体膜中叶绿素的全部能量耗散。早期应用的技术诸如阻断电子传输的除草剂之类的化学物质在PSII (Krause et al., 1982; Horton and Hague, 1988)到去除光化学淬灭，从而给出光化学在应用之前的指示。 除草剂。显然，这在日常基础上是不实际的，并开发了涉及应用的技术。短暂的（lt;1s）非常明亮的饱和闪光暂时关闭所有PSII反应中心的持续时间应用(Bradbury and Baker, 1981; Quick and Horton, 1984). 在闪光期间，反应中心是关闭（参见图1），因此光化学淬灭的水平实际上是零，并且仅是非光化学过程。将继续存在。饱和的基本原理闪光/脉冲是荧光上升到与没有光化学存在的水平相对应的水平淬火。
常用计算荧光参数
图2显示了“典型”的荧光痕迹类型。重复使用，以简化叶绿素荧光的原理，并提供我们如何解释。可以得出关于性能的重要信息PSII通过比较荧光水平同时暴露叶子到光化光的组合（即驱动光）。光化学与光合作用，黑暗与系列饱和脉冲。这是围绕着光化学与非光化学的分离组件。在黑暗适应状态下（当所有PSII中心开放时）并且没有NPQ存在，一个“测量光”被打开（图1, 2）。这种光线强度太低，无法感应。电子传递通过PSII，但高到足以引起 叶绿素荧光的最小值，称为FO。FO的测量及其光适应当量FO是荧光分析和注意的基础。 应注意的问题和建议在这篇综述中。切换后立即测量FO离开光化光，但精确测量是困难的： 许多仪器都有能力施加微弱的远红光。（FR）测量FO和FO的光（通常几秒钟）。FR光刺激PSI，从PSII中提取电子确保QA在测量过程中保持完全氧化。这是重要的，因为QA可以部分地减少在黑暗中通过氯呼吸（见 Peltier and Cournac, 2002）。另一种方法是计算FO： 见下文
图2。用暗适应叶材料测量光化学和非光化学参数的典型实验的程式化荧光示踪。这将是典型的高辐照度超过500mu;mmu;m - 2 s - 1的诱导。一个真正的“kutsky效应在中等照度下测量，例如＜200mu;mu;mol m－2 s－1，其中对应于光合作用的瞬变。显露出来。注意，在关闭光化光后，黑暗中的“衰变”会通过增加FR光来加速。刺激PSI活性。文中给出了更多的解释。
饱和脉冲应用于暗适应叶通过关闭反应来诱导荧光的最大值中心。 此时，在一个健康的非重压植物中没有NPQ，因为材料已经完全黑暗适应;因此，荧光的最大可能值Fm是记录。 Fo和Fm之间的差异是变量荧光，Fv。 从理论上和实证上已经表明，Fv / Fm给出了最大值的强有力指标PSII化学的量子产率 (Butler, 1978; Genty et al., 1992)。对于未受胁迫的叶子，Fv / Fm的值是高度一致的，值为〜0.83，并且与最大值光合作用的量子产量 (Demmig and Bjouml;rkman, 1987)。存在导致PSII失活损伤的任何类型的“压力”（通常称为光抑制，见下文） (Long et al., 1994) 或诱导持续淬火 (Demmig-Adams and Adams, 2006)导致a降低Fv / Fm。 这意味着在适当的暗适应期之后测量Fv / Fm被用作测量最常用的技术之一叶中的压力。
如果现在应用了足够强的光化光，我们就会看到荧光初始升高。 然后这会被终止与光化学和非光化学事件的竞争越来越激烈。 荧光的稳态水平在光中被称为F。 一般来说，可能需要几分钟或更长的时间（例如gt; 20分钟）来实现a从暗适应状态开始稳定状态。 a的应用在光化照明下的饱和脉冲瞬时闭合所有的反应中心并在光适应状态下提供最大荧光值，称为Fm。 请注意这一点由于贡献而小于暗适应的Fm值的NPQ。
如果我们同时具有暗适应和光适应测量，我们可以测量三个关键参数。
(i)PSII光化学的操作效率，Fq/ Fm（Genty et al., 1989）是从（Fm-F）/ Fm（和
不需要暗适应测量）。这个参数通常被称为phi;PSII或Delta;F/ Fm（(Maxwell and
Johnson, 2000; Baker, 2008）。它给出的比例吸收PSII光化学中实际使用的光
（Genty et al., 1992），因此可以用来估计通过PSII通过知识传输电子的速率
光吸收的叶和光系统（其中有与之相关的技术困难，这将在下面讨论）。由于其测量简单Fq/ Fm是最常用的测量和使用的光适应参数。 Fq/ Fm可以分解为两个产品，PSII的光化学猝灭水平（Fq/ Fv）和PSII最大效率（Fv/ Fm）（一个参数描述了光适应状态下的最大工作效率，反映了该参数的任何下降NPQ的增加）。
(ii)PSII的光化学猝灭水平Fq/ Fv（通常称为qP：表1）给出了一个指示
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