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一种反硝化聚磷菌的生物学特性

摘 要：为了分离高效反硝化聚磷菌(DPAB)以达到同步脱氮除磷的目的，则有必要了解它们的生物学特性。本研究通过反硝化筛选、聚磷酸盐(poly-P)和聚beta;-羟基丁酸酯(PHB)颗粒染色、硝酸盐还原、硝酸盐还原生成N₂以及磷吸收试验，分离得到了一株高效DPAB菌株。通过16S rDNA测序和生理生化分析，该菌株被鉴定为Thauera菌属，并被命名为N11。该菌株的生长很明显受到氮源、碳源、温度以及pH(p＜0.05或p＜0.01)的影响。LB被测为是最佳脱氮培养基，且最佳pH值为8，最佳温度为35℃。在最佳条件下培养32h，细菌能持续保持活性，OD₆₀₀值维持在约1.8左右，菌落数为1.826times;10¹³-3.218times;10¹³cfu/mL。在合成废水中对N11进行厌氧-好氧培养，细胞中的聚羟基脂肪酸(PHA)含量从22.8mg/L增加到150.6mg/L(在厌氧条件下，12h)，然后逐渐下降到20.4mg/L(在好氧条件下，24h)。培养基上清液中磷酸盐（PO₄^3--P）的浓度从4 mg/L增加到20.8 mg/L(在厌氧条件下，12h），然后逐渐下降到3.08 mg/L(在好氧条件下，24h)，除磷率为80.38%。硝酸盐氮(NO₃^--N)浓度由75.45mg/L下降到7.12mg/L。亚硝酸盐氮(NO₂^--N)浓度较低(le;1.29 mg/L),脱氮率为89.96%。本研究介绍了一种新型的DPAB菌株以及利用这种菌株进行脱氮除磷的最佳条件。

关键词：生物学特性; 反硝化聚磷; 细菌(DPAB); Thauera菌属; 脱氮率; 除磷率

1 引言

氮、磷污染物是内陆湖泊、水库、河流富营养化的主要原因，同时去除这些元素也是废水生物处理的主要目标。传统的生化工艺可以有效降低废水的生物化学需氧量(BOD)和悬浮物(SS)的含量，但只能去除10-30%的氮和磷。近30年来，许多污水处理厂开始利用微生物去除氮和磷(Kuba et al.,1996;Xia and Liu, 2004)，然而反硝化细菌与聚磷菌(PAB)在有限的碳源方面存在竞争，硝化细菌和PAB的相对丰度随污泥龄的变化而变化，这给优化污水处理系统以实现同步脱氮除磷带来了挑战(Meinhold et al., 1999)。

反硝化聚磷菌(DPAB)是一种兼性厌氧菌，可以利用O₂、NO₃^--N或NO₂^--N作为最终的电子受体，在好氧条件下吸收磷或在厌氧条件下释放磷。然而，这两个过程在这些生物体中并不平衡，都明显偏向于磷的吸收过程(Li and Huang, 2013)。这些生物的发现为解决碳利用和污泥龄之间的矛盾提供了可能，从而可以实现同步脱氮除磷(Bortone et al., 1999; Lee et al., 2001; Guo et al., 2014)。最近，从Acinetobacter(Tsuneda et al., 2006)、Alcaligenes(Li et al., 2006)、Aeromonas(Wang et al., 2008)、Comamonas(Lu et al., 2009)、Pseudomonas(Cai et al., 2010)、Bacillus(Ma et al., 2011)、Paracoccus(Zhang and Wu, 2012; Liu et al., 2013)、Planctomycetes(Liu et al., 2013)等菌属中分离DPAB的研究已经取得了进展。本研究通过除磷能力、硝酸盐还原成N₂以及异染颗粒染色的筛选方式，分离出了一种属于Thauera菌属的高效同步脱氮除磷细菌DPAB。然而，到目前为止，关于影响Thauera菌属生长和退化特性的因素的信息还很少。确定这些因素将有助于优化其功能，并通过生物反硝化除磷提高废水生物脱氮除磷工艺的效率。因此，本研究具有一定的理论价值和现实意义。

2 材料和方法

2.1 基质

LB培养基：5g 酵母提取物、1g 蛋白胨、5g NaCl、1L ddH₂O、pH 7.0–7.2(如果是固体则添加0.025kg琼脂)。

LB富磷培养基：LB培养基中添加2.5g K₂HPO₄和0.25g KH₂PO₄，pH 7.0–7.2。

富集培养基：5g CH₃COONa·3H₂O/5mL丙酸，2g KNO₃，0.2g MgSO₄·7H₂O，2g K₂HPO₄，2mL 微量元素，1L ddH₂O，pH 7.2。

1%溴麝香草酚蓝(BTB)-脱氮培养基：5.0g CH₃COONa·3H₂O，2.0g KNO₃，0.2g MgSO₄·7H₂O，20g 琼脂，4ml 1%BTB，1L ddH2O，pH值 7.6。

脱氮除磷培养基：2g/L KNO₃，5g/L CH₃COONa·3H₂O，0.05g/L K₂HPO₄，0.2g/L MgSO₄·7H₂O，0.5g/L CaCl₂，2ml/L 微量元素溶液。

反硝化富磷培养基：2g/L KNO₃，5g/L CH₃COONa·3H₂O，0.05g/L K₂HPO₄，0.2g/L KH₂PO₄，0.2g/L MgSO₄·7H₂O，0.5g/L CaCl₂，2ml/L 微量元素溶液。

选择性培养基母液：CH₃COONa·3H₂O 5g/L；K₂HPO₄ 0.05g/L；KH₂PO₄ 0.2g/L；MgSO₄·7H₂O 0.2g/L；CaCl₂ 0.5g/L；微量元素溶液 2mL/L，pH 7.0-7.6。

微量元素溶液：1.5g/L FeCl₃·6H₂O、0.15g/L H₃BO₃、0.03g/L CuSO₄·5H₂O、0.03g/L KI、0.06g/L Na₂MoO₄·2H₂O、0.12g/L MnCl₂·4H₂O、0.12g/L ZnSO₄·7H₂O、0.12g/L CoCl₂·2H₂O。

除LB外其余生化试剂均为分析级，用0.1mol/L HCl和0.1mol/L NaOH调节pH值。

2.2 DPAB富集培养及筛选

2.2.1 富集培养

向富集培养基(200mL)中加入10克活性污泥。培养在26℃下，在厌氧/缺氧(12h/12h)条件中分批培养并以140 转/分摇动。每4天为一个周期，培养10个周期。在每次循环结束前两天，加入醋酸钠以提供碳源，2天后，添加丙酸以提供碳源，并用新鲜培养基代替一半培养液。细菌繁殖后收集0.5mL培养悬浮液，进行10^-1-10^-9的连续稀释。固体LB琼脂接种0.1mL稀释液，一式两份，在26℃培养箱中培养2-3天。单菌落经6次挑拣和划线培养，分离出纯菌落。

2.2.2 菌株筛选

反硝化细菌的筛选：分离单个菌落，在1% BTB脱氮培养基上划线，在26℃下培育2天。脱氮培养基以KNO₃为底物，BTB为pH指示剂。蓝色菌落即为所选反硝化细菌。

Poly-P和PHB染色：对所选菌株的异染颗粒和PHB颗粒进行染色。阳性菌株则为DPAB。所有菌株在4℃的LB培养基斜面培养中保存。

种子培养：上述菌株在26℃的100毫升LB培养基中以140转/分振荡24小时。培养物以4000转/分离心分离30分钟。用无菌生理盐水稀释细菌颗粒，将光密度(OD₆₀₀)调整为1.0。

脱氮除磷率测定：将种子培养物在100mL脱氮除磷培养基中稀释至0.1的OD₆₀₀，并在26℃的氩气下，以140转/分的速度振荡培养12h。培养物以4000转/分离心30分钟，用无菌生理盐水洗涤两次，然后在200mL反硝化富磷培养基中重新悬浮至0.1的OD₆₀₀。该培养悬浮液在26℃的有氧条件下继续培养24小时并以140转/分的速度振荡。培养上清液中PO₄^3–-P、NO₃^–-N、和NO₂^–-N的吸光度用分光光度法测量，结果如下所示。根据吸光度的变化来计算脱氮除磷率。

以下方程式用于确定除磷率和脱氮率：

脱氮率： (1)

除磷率： (2)

上式中：eta;₁—脱氮率，%；

A—NO₃^--N的初始吸光度，abs；

A_t—时间为t时NO₃^--N的吸光度，abs；

B_t—时间为t时NO₂^--N的吸光度，abs；

eta;₂—除磷率，%；

C—PO₄^3--P的初始吸光度，abs；

C_t—时间为t时PO₄^3--P的吸光度，abs。

选择脱氮率和除磷率分别高于70%和50%的菌株作为实验菌株。

2.3 菌株的形态、生理生化特性

菌株的这些特性根据先前文献报道的方法进行确定(Dong and Cai, 2001)。

2.4 16S rDNA PCR聚合酶链式反应扩增

以细菌基因组DNA为模板，用一对通用引物扩增16S rDNA：上游引物(7F)，5′-CAGAGTTTGATCCTGGCT-3′；下游引物(1540R)，5′-AGGAGGTGATCCAGCCGCA-3′。PCR系统：模板，0.5mu;L；5times;缓冲液(含Mg² )，2.5mu;L；dNTPs，1mu;L；上游和下游引物中添加0.5mu;L ddH₂O，使体积达到25mu;dL。PCR操作步骤如下：98℃下变性3min；在98℃下变性25秒反复进行30个周期，再在55℃下退火25秒，72℃延伸1分钟；最后在72℃延伸10分钟，于4℃时终止。PCR产物经琼脂糖凝胶电泳分析，送往中国上海生物科技有限公司测序。

2.5 不同培养条件对细菌生长特性的影响

制备所需培养基(150mL)：向OD₆₀₀为0.1的培养基中注入氧气，再在140转/分的摇瓶上培养24h，然后在600nm处测量吸光度。

2.5.1 氮源

在选择性培养基母液中加入蛋白胨、酵母提取物、NaNO₂和KNO₃；按C/N=10加入亚硝酸钠和KNO₃，按1% w/v加入蛋白胨和酵母提取物。此外，制备一种复合氮源培养基(LB)，pH为

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