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使用新分离的溶解性噬菌体对Haliscomenobacter hydrossis引起的生物膨胀进行生物调控的研究

Shireen M. Kotay ^a , Tania Datta ^b , Jeongdong Choi ^a , Ramesh Goel ^{a, *}

^a Department of Civil and Environmental Engineering, University of Utah, 122 S. Central Campus Drive, 104 CME, Salt Lake City, UT, USA ^bCH2M Hill, Salt Lake City, UT, USA

ARTICLE INFO: Article history: Received 11 June 2010 Received in revised form 15 August 2010 Accepted 20 August 2010 Available online 27 August 2010

摘要:本研究证明了以Haliscomenobacter hydrossis作为模型丝状细菌的活性污泥系统为研究对象，首次应用溶解性噬菌体（病毒）来调控生物膨胀。噬菌体是一种只感染细菌的病毒。溶解性噬菌体只感染从当地废水处理厂的混合液中分离出的H. hydrossis。所分离的噬菌体属于Myoviridae科，具有可收缩性的尾部（长度126 nm；直径18 nm）和二十面体头部（直径81 nm）。经分离带H. hydrossis的噬菌体的适宜滴定量为5.2plusmn;0.3times;10⁵ PFU/mL，被感染的细菌的裂解大小为105plusmn;7 PFU/感染细胞。噬菌体在暴露于高温（42^oC）和5至8的pH值时相当稳定，这说明它在实际应用中可以适应季节性和操作性波动。最佳感染时，噬菌体与宿主（细菌）之比为1：1000，此时宿主的死亡率约为54％。分离出的噬菌体与活性污泥系统中最常见的其他细菌不发生交叉感染，因此验证了它适用于生物调控由H. hydrossis引起的丝状膨胀。噬菌体应用后，污泥体积指数（SVI）从155成功降低到105，提高了生物沉降的效果。同时，噬菌体的应用不会影响微生物的营养去除效率，说明其对微生物没有损害作用。与医学应用中的噬菌体疗法相似，噬菌体介导的生物调控作为一种经济试剂，在大规模应用于缓解许多水、废水和环境问题中具有巨大潜力。这项课题是一个新的研究方向。

关键字：H.hydrossis，丝状细菌，污泥膨胀，噬菌体，生物防治

1.简介

噬菌体是感染细菌的病毒，已知是淡水和海水生态系统的非常重要的组成部分。噬菌体具有驱动和控制细菌群落结构的能力（Breitbart和Rohwer，2005)。Metagenomic分析表明，环境中的病毒群落极为多样（Weinbauer（2004）)。在200 L的海水中，估计有5000种病毒基因型。在1千克海洋沉积物中的百万种病毒基因型（Breitbart和Rohwer，2005)。在自然界中，海洋生态系统，海洋冰层，沉积物，土壤中已经报道了噬菌体的丰度和多样性（Weinbauer 2004；Wommack和Colwell，2000）以及工程系统，例如饮用水分配系统，废水和活性污泥生物反应器（Otawa et al., 2007；Weinbauer，2004；Wu和Liu，2009)。有关上述自然和工程系统中噬菌体的公开信息提供了充分的证据，证明噬菌体在所有营养循环和致病的生物过程中都起着关键作用。

活性污泥法是市政废水处理中广泛使用的方法之一。活性污泥工艺的性能是由复杂的原核生物群落驱动的。活性污泥系统中的群落组成与包括海洋在内的许多其他水生系统一样复杂和多样。活性污泥系统已显示每毫升包含10⁸-10⁹ 噬菌体（Ewert和Paynter，1980；Otawa et al.，2007），其数量与大多数水生系统中发现的噬菌体数量相当或更高。说“病毒统治世界”并不过分。然而，迄今尚未研究过噬菌体介导的活性污泥系统中细菌群落的变化以及噬菌体对工艺性能的影响。尽管活性污泥法是一种已在世界范围内采用的成熟处理技术。频繁发生的过程混乱，污泥膨胀和泡沫仍然是困扰这些过程的一些无可争议的问题。

活性污泥过程中的污泥膨胀是由于丝状细菌的过度发育（Eikelboom，1977；Eikelboom和van Buijsen，1981；Ziegler et al.,1990），这是活性污泥系统中的主要运行问题之一。从废水处理厂中，已经鉴定、分离和发现了导致污泥膨胀的几种丝状细菌。Microthrix parvicella，Sphaerotilus natans，Eikelboom type 1702，Haliscomenobacter hydrossis，Nocardia，Thiothrix spp等等（da Motta et al., 2003; Eikelboom, 1975; Kampfer, 1995; van Veen et al., 1973; Williams and Unz, 1985)。污泥膨胀会导致二沉池沉降不良，并使未沉降的生物质随废水一起逸出。传统上采用工程操作条件来解决污泥膨胀的问题，这些操作主要基于过去的工程观察而没有足够的微生物学见识。因此，不清楚具体微生物之间的因果关系及其在丝状膨胀中的作用。为了控制污泥膨胀，过去曾尝试过物理化学方法，例如控制回流的活性污泥的流速，增加通气量，添加絮凝剂/凝结剂和氧化剂（Xie et al.，2007)。表面活性剂和氯也可用于控制丝状膨胀的不同尝试（Caravelli et al., 2007; Seacute;ka et al., 2003 和 Xie et al., 2007)。由于各种原因，上面提到的大多数减轻丝状膨胀的尝试均未被认为是可持续的和/或具有成本效益的。例如，添加氯可能会引发卤化有机物的形成，这可能对水体造成潜在威胁。Lou 和 de los Reyes (2008)提出了一个概念框架，他们将底物（营养物）浓度和底物扩散速率的动力学归因于驱动丝状细菌生长的主要因素。污泥体积指数（SVI）是用来区分生物质沉降好坏一个的工程参数。SVI值介于50和100之间被认为是良好的，SVI值介于100和150之间是丝状生长，而150以上则是膨胀（Lee et al., 1983)。

噬菌体可以感染单个宿主或多个宿主（Weinbauer, 2004; Jensen et al., 1998)。基于噬菌体的宿主特异性，噬菌体疗法已用于医疗应用和肉类工业，其目的是分别感染目标细菌以治愈疾病和对肉类进行消毒（Kropinski, 2006; Withey et al., 2005)。同样，污泥膨胀最通常是由于丝状细菌（称为丝）的过度生长引起的，因此可以使用噬菌体疗法进行控制，也可以使用噬菌体进行生物防治以减少丝状细菌的种群。关于基于噬菌体的生物防治在调节丝状细菌种群和提高生物量沉降能力方面的应用尚无公开报道。此外，关于活性污泥系统中噬菌体类型及其遗传多样性的信息很少（Breitbart 和 Rohwer, 2005)。然而，有证据表明自然界中存在感染这些丝状细菌的溶解性噬菌体（Jensen et al., 1998; Kampfer, 1995; Winston and Thompson, 1979; Wommack and Colwell, 2000)。

Withey 等 (2005)对使用噬菌体缓解活性污泥系统中细菌生态学相关问题的可能性提供了极好的理论。有了这种理论，我们就提出了使用基于噬菌体的生物控制污泥膨胀的想法。H.hydrossis是一种带鞘的丝状细菌，由于其易于识别的形态学外观，已在全世界的活性污泥样品中检测到：硬质直丝，长度在10到200 mm之间，直径在0.3 mm至0.5 mm之间，从絮状物表面延伸（细针状外观）和革兰氏阴性染色（Eikelboom, 2006)。这项研究仅限于作为模型丝状细菌的H.hydrossis和由该细菌引起的膨胀。本研究的目的是：（i）分离，纯化和鉴定特异性感染H.hydrossis的溶解性噬菌体；（ii）在实验室规模设置中证明使用分离的噬菌体进行生物防治的应用；（iii）研究添加新分离的噬菌体是否将对去除有机物和营养物的活性污泥工艺性能产生任何影响。

在对由H.hydrossis引起的膨胀进行生物控制研究证实后，该应用将推广应用于活性污泥系统中其他几种引起丝状膨胀及泡沫的细菌。此外，由于噬菌体是宿主特异性的，对高等生物没有致病性（Weinbauer, 2004; Withey et al., 2005），使用噬菌体对丝状细菌和其他有害生物的种群进行生物调控不会对健康造成任何威胁。

2.材料和方法

2.1细菌菌株

H.hydrossis（ATCC＃27776）从美国模式培养物集存库（ATCC）获得，并按照ATCC的指示在733 SCY培养基（不含dextrose的Tripticase 大豆肉汤0.25 g，在1 L去离子水中的casitone 0.75 g）中于37 ⁰C。Escherichia coli K12，Pseudomonas aeruginosa，Nitrosospira multiformis（ATCC＃25196），Nitrosomonas europea（ATCC＃19718）和Desulfovibrio desulfuricans ND132进行交叉感染性研究。

2.2 以H.hydrossis为宿主分离噬菌体

来自实际污水处理厂的生物质样品（称为混合液）被用作有毒噬菌体的来源。混合液样品依次通过0.45微米和0.2微米过滤器（Millipore, CA），以去除细菌和其他悬浮杂质。将大部分含有溶解物质和噬菌体的滤液收集在预先高压灭菌的玻璃烧瓶中。使用Amicon Ultra-4（Millipore，CA）Uitracel-30k和MWCO 30,000将滤液浓缩成噬菌体。浓缩的噬菌体提取物在4⁰C下保存，直至进一步使用。为了分离对丝状细菌特异的溶解性噬菌体，使用已建立的方法顶琼脂平板技术。让模型丝状细菌H.hydrossis生长过夜，并将此生长过夜的培养物10 mL与1 mL浓缩噬菌体提取物和3 mL 0.75％SCY琼脂（SCY培养基 0.75％ w/v细菌琼脂）混合。将该混合物充分搅拌并覆盖在预制的2％SCY基础琼脂平板上。0.75％琼脂的顶层不会像基础2％琼脂那样迅速固化，因此它将允许宿主细菌和噬菌体在琼脂内均匀分布。这导致孵育后形成分离的噬菌斑。使培养皿凝固，并在37⁰C下孵育过夜。还按照相同方案制备阴性对照板。除浓缩的噬菌体提取物外，对照板包含上述所有物质。温育后，将出现在平板上的噬菌斑的毛细管之一仔细挑选并重新悬浮在SMG缓冲液中（5.8 g/L NaCl，2.0 g/L MgSO₄-7H₂O，5.0 mL/L 5％明胶溶液，50 mL/L 1M Tris-HCl pH 7.5)。噬菌斑进一步通过在新鲜的H.hydrossis平板上反复感染。纯化的分离的噬菌体在SMG缓冲液中于4⁰C下保存，直至进一步使用。

2.3 使用epifluorescence microscopy（EFM）进行病毒计数

从细菌噬菌体混合物中，取出一式三份样品进行病毒计数。首先将样品通过孔径为0.22微米的过滤器（Millipore Co. Bedford，MA）进行过滤，以去除死去的未溶解细菌和其他悬浮固体。将滤液收集在新鲜的高压灭菌烧瓶中。为了排除噬菌体提取物中存在的游离细菌DNA，将900 ml 噬菌体溶液转移到装有100 mL RQ1反应缓冲液和2 mL不含RNase的DNase I（Invitrogen）的新鲜聚丙烯管中。添加DNase后，将样品在37⁰C下温育20分钟，然后添加35 微升的0.5 M EDTA以终止DNase活性

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