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一体式A/O反应器处理稀释畜禽废水启动期的微生物群落结构

摘要

为研究反应器性能与微生物的关系，采用一体化A/O反应器处理稀释的畜禽废水72天。化学需氧量（COD）去除效率ffi从79%增加到94%，总氮去除率E（TN）ffi从37%到50%（HRT 7.4小时）当进水COD和TN约1500毫克/升和95毫克/升，分别与出水COD浓度小于100 mg/L的最后。用16S rRNA基因变性梯度凝胶电泳（DGGE）对发酵过程中的微生物群落进行监测。DGGE图谱表明，微生物群落在启动过程中发生了显著变化，这些变化与反应器性能相一致。UPGMA聚类分析表明：14个厌氧样品下跌主要分为五个组，所以没有好氧的，但分组模式是不同的。系统发育分析表明，厌氧室中微生物种群属于厚壁菌门，变形菌，杆菌，变形杆菌，绿弯菌，杆菌，厚壁菌门，疣微菌属和硝化螺旋菌门在好氧室。在厌氧发酵产氢产乙酸检测室，更多和启动中的反硝化细菌是细菌而消失。两个功能群如脱硝化菌产甲烷菌和脱氯，脱氮进行观察时，脱氮率高，说明同步硝化反硝化作用发生在好氧区。

关键词：关键词：集成A / O反应器; 社区结构; 动力学; 变性梯度凝胶电泳

介绍

环境生物技术被广泛用于治理市政，工业和农业废水（Wagner等人，2002）。畜禽废水含有高浓度的有机物质，氮和磷。许多国家都关注其污染造成的严重影响。粪便处理的一个有益和有利的过程是厌氧消化（Sakar 等人。，2009），在此期间沼气可以作为资源回收，液体和污泥可以用于土地的应用。在美国和加拿大的许多地方，建筑和天然湿地正用于畜牧废水处理（Knight等人，2000）。一些研究人员更倾向于采用厌氧/好氧（A / O）过程工艺（Su等人，1997; Kim等人，2008），因为厌氧消化产生的气味和大占地面积等问题可用湿地解决。然而，为了经济，社会和环境效益，需要高效低成本的废水生物处理系统。综合生物处理系统由于其经济可行性，对土地和能源的要求较低以及易于管理而成为一个很有前途的过程。

A / O联合系统已被证明能够有效地处理家庭和工业废水（van der Zee和Villaverde等人，2005），尤其是同时去除有机污染物和营养物质（Lacalle等人，2001; You等人，2003; Ahn等人，2007）。 A / O系统的一些原型已经开发出来，应用在不同区域（Barber and Stuckey，2000a，2000b）或反应堆（Bernet等人。，2000; Tai 等人。2006; An 等人。 2008）。但是，缺乏综合系统的集成的知识。这种允许在同一反应器内同时存在厌氧和有氧菌群的系统。这种系统是由Fdz-Polanco等人开发的（1994）和Chui等人（2001），其中在中等高度引入曝气，而Del和Diez（2005）探索了一个具有平行厌氧和好氧区的固定膜反应器。虽然有关于A / O系统中涉及微生物的研究（Sofia等，2004; Lu等，2006; Wang等，2009），但综合反应堆的研究尚不清楚。

微生物在废水的生物处理过程中起着关键作用，了解微生物群落结构对提高反应器性能具有重要意义（Xing 等人。，2005; Ren等人，2007）。此外，启动是在各种生物处理过程中建立适当的社区结构的重要一步（Liu 等人，2002）。 在此期间，反应器性能数据和微生物信息对揭示污染物去除与微生物群落之间的相关性至关重要。

在这项研究中，提出了一体式A / O反应器被用来处理稀释的畜禽废水，以同时去除有机碳和氮，以便更多地了解整合系统。 由于缺乏关于这些过程中涉及的微生物的研究，我们调查了启动期间的微生物群落结构和动态。 使用聚合酶链式反应（PCR） - 变性梯度凝胶电泳（DGGE）监测微生物群落的演替，并且因此对主要条带进行测序，以揭示微生物群落组成。 具体而言，进行DGGE分析的UPGMA聚类分析以评估微生物群落的变化。

1.材料和方法

1.1反应和操作

一体式A / O反应器由UASB（上流式厌氧污泥床）和MBR（膜式生物反应器）组成。（如图1）。 中空聚丙烯纤维膜组件（孔径0.1mu;m，长度0.15m，有效过滤面积0.5m²）浸没在MBR中。 进水溶液流入厌氧UASB，然后流入好氧MBR。 在安装了循环管线后，将好氧室中的溶液（硝化作用）循环回到存在反硝化作用的厌氧反应器中，循环比率为200％。 厌氧（UASB）和好氧（MBR）室的工作容积为7.8L和3.5L。从厌氧反应器中分别处理啤酒废水和文昌污水处理厂（中国哈尔滨）二沉池回流活性污泥流，收集厌氧和好氧室的污泥接种物。所有操作均在（31plusmn;1）°C下进行。整合的A / O反应器的HRT为7.4小时（厌氧为5.2小时，好氧为2.2小时）。使用前，牲畜废水化学需氧量（COD）、总氮（TN）每天测量，根据标准方法（APHA，1995）。

图1集成A / O反应器示意图。 （1）饲料桶; （2）蠕动泵; （3）温度传感器; （4）温度控制器; （5）三噬菌体分离器; （6）碱性吸收剂; （7）燃气表; （8）再循环泵; （9）单向阀; （10）膜组件; （11）反冲洗控制器。

1.2采样和DNA提取

污泥每隔6天从厌氧和好氧室取样。对于每个样品，100毫克的污泥（湿重）收集离心（12000 r/min，5 min）（64r J-25，Bechman，美国），和细胞颗粒与PBS液洗两次（mmol/L：氯化钠137，氯化钾 2.7，磷酸氢二钠10；pH值7.4）。从制备的样品使用快速DNA试剂盒提取基因组DNA（Watson，中国）。用0.8%（重量/体积）琼脂糖凝胶电泳检测DNA提取液。

1.3 PCR扩增

用于PCR扩增的16S rDNA的细菌通用引物是GC夹（5CGCCCGCCGCGCGCGGCGGGCGGGGCGGGGGCACGGGGGG-3）的BSF968,5-AACGCGAAGAACCTTAC-3（大肠杆菌16S rRNA位置968-984），BSR1401 ，5-CCCCGTCAA TTCCTTTGAGTTT-3（1385-1401的大肠杆菌16S rRNA位置）（Nuebel等，1996）。 PCR反应液中含有10 mu;L10times;E^x Taq buffer（含有Mg² ），0.5mu;L各引物（20pmol /mu;L），1mu;LdNTP（2.5mmol /mu;L），100ng模板，0.1mu;LEx Taq（Takara，日本）和无菌水，最终体积为20mu;L。 PCR扩增在自动热循环仪（GeneAmp PCR 系统 9700，Applied Biosystems，USA）中进行。降落PCR按照以下程序进行：94℃初始变性5分钟，接着35个循环的94℃变性40秒，在每循环降低0.5℃的温度下从55℃退火至51.5℃持续40秒，72℃延伸30秒，最后延伸72℃7分钟。通过0.8％（wt./V）琼脂糖凝胶电泳测定PCR产物。

1.4变性梯度凝胶电泳

如前所述（Ren等人，2007; Xing等人，2008）使用Dcode通用型检测系统（BioRad，USA）进行DGGE实验。 将PCR扩增的16S rDNA片段加载到6％的聚丙烯酰胺凝胶上，其中变性剂的线性梯度为30％至60％（其中100％变性剂对应于7mol / L尿素和40％（V / V）甲酰胺）。 电泳在150V的恒定电压下在60℃下进行6小时，随后对凝胶进行染色。

1.5 克隆和测序

从DGGE凝胶中切下主要条带用于核苷酸序列测定。 将各选择条带的凝胶在50mu;LTE缓冲液（10mmol / L Tris-HCl，1mmol / L EDTA，pH8.0）中粉碎并脱洗以回收16S rDNA片段。 在与上述相同的条件下再扩增的DNA片段通过纯化并通过pMD19-T质粒载体系统（TaKaRa，Japan）克隆。 通过使用相关仪器（Sangon，China）在ABI 3730DNA测序仪上通过链终止法确定DNA序列。 使用BLASTN程序将所有序列在GenBank数据库中进行比对。

2. 结果与讨论

2.1 反应堆性能

在启动期间，不断监测一体式A / O反应器的性能。 当进水COD浓度为1500 mg / L时，厌氧室的COD浓度从600 mg / L降至240 mg / L，COD去除率从57％增加到84％（图2）。 对于好氧隔室，尽管入口和出口COD浓度都呈现下降趋势，但再生效率从44％上升到61％。 在整个过程中，总COD去除率从79％提高到94％，出水COD浓度低于100 mg / L，可直接排入环境。

COD含量

去除率

进水COD 总COD去除率

厌氧舱内COD 厌氧COD去除率

出水COD 出水COD去除率

时间（天）

图 2

TN的浓度和去除效率如图3所示。进水TN浓度在第48天从95 mg / L（平均）增加到120 mg / L，并且厌氧菌的TN浓度也相应增加， 导致厌氧舱的TN去除效率相对稳定在10％ - 20％之间。 总TN去除效率与好氧隔室的趋势相同，可以分为三个阶段：第6天的TN去除效率有所下降，然后逐渐恢复并在第6天从37％和23％增加 第48天分别降至50％和42％。 随着入口TN浓度的增加，去除效率在第48天后的几周内急剧下降，然而，在过去的几天中，TN去除效率略有增加。

进水TN 总TN去除率

厌氧舱内TN 厌氧TN去除率

出水TN 出水TN去除率

TN含量

去除率

时间（天）

图 3

与其他研究相比，COD去除效率是令人满意的，而TN去除效率不如预期。 Nunez#39;和Mart#39;ınez（2001）使用UASB在0.084 kg N /（m³bull;day）的负荷率下获得了93％的COD去除率，负载率为0.77 kg COD /（m3bull;day）和67％的TN去除率活性污泥反应器供应屠宰场废水，COD浓度分别为1820 mg / L和总氮量分别为190 mg / L。 Jun等人还实现了94％的COD去除率，72％〜85％的反硝化效率和56％〜70％的TN去除率。 （2004年），集成了USB和好氧生物过滤系统，以24小时的总HRT喂入未经处理的污水。当进水COD和TN分别约为600 mg / L和60 mg / L时，使用集成的UASB-Jet环路反应器生物反应器系统，在HRT为44小时时，COD去除率为92％，TN去除率为78％。在各种研究中获得的不同性能可能是由于使用不同的反应器类型，不同的操作条件和不同的底物，然而，所有这些研究在厌氧条件下都成功地进行了反硝化和甲烷生成的反应。

2.2 微生物群落动态

通过DGGE分析观察到厌氧舱启动期微生物群落结构的显着变化（图4）。 在此期间，存在于污泥接种物中的一些条带（A13，A16，A18，A20，A21，A22和A23）逐渐消失，而留下少量条带（A3，A8，A9，A11和A15）。 与此同时，其他条带（A7，A17和A24）随后出现甚至加强。 最后，检测到的条带较少，其中将近一半是主导条带（条带A7，A8，A11，A15和A17）。 这些变化主要是由操作参数造成的，这对微生物群落产生了选择压力。

图4 图5

UPGMA聚类分析显示14个厌氧 - 肥胖样品分为五个主要组别（图5）。 一般来说，不同组之间的相似性在启动期间下降，这与反应堆性能的逐渐增加相一致。 由于在启动期间还不稳定，因此观察到微生物群落组成短时间内有相当大的变化。 然而，由于大量的微生物能够降解有机化合物，因此在该厌氧隔室中未出现表现功能冗余的效果处理性能。 两个月后，微生物群落达到相对稳定的阶段。 可以得出结论，UASB促进了微生物群落的动态变化和长期稳定性，从而解释了该系统对微生物波动的高度适应性。

启动期间的迁移也存在于好氧隔间（图6）。 在前36天，微生物群落几乎保持稳定。 然后在样本O36d中同时出现了一些条带（O1，O2，O8，O20，O21，O23和O25），而O11，O12和O15中的条带数量很少开始增加。 相比之下，O3，O9和O18条带逐渐消失。 然而，在第66天显示出相反的趋势。这些观察结果表明这些微生物之间的合作和竞争。 对于好氧隔间，14个样品也分为五个主要组别（图7）。 但社区相似性并不强烈依赖于时间，五个主要群体形成了O30d和O36d之间分隔的两大群集。 微生物群落必须逐步改变，然后一段时间才会出现重大转变。

图6 图7

2.3 微生物群落结构

对厌氧和好氧区DGGE凝胶中的50条优势条带进行了序列鉴定（表1和表2）。在无氧环境中厚壁菌门（主要是乳杆菌和梭状芽孢杆菌），变形杆菌和拟杆菌。这一结果与之前关

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