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外文原文出处：中国天然药物2018,16(1):0070-0080

通过转化为纳米混悬剂，可以提高肝能滴丸的稳定性和口服生物利用度

LI Juan-Juan, CHENG Ling, SHEN Gang, QIU Ling, SHEN Cheng-Ying,

ZHENG Juan, XU Rong, YUAN Hai-Long

[摘要]本研究旨在通过将由波棱瓜（HPE）和波棱素（HPN）组成的波棱瓜子（HL）木脂素转化为纳米悬浮剂（HL-NS），来提高肝能滴丸（GNDP）的稳定性和口服生物利用度。利用高压乳匀法和冻干技术制备了GNDP的主要活性成分，并将其转化成固体纳米颗粒（HL纳米颗粒），然后将制备的HL纳米颗粒灌注到基质中，通过熔融法获得NS-GNDP。在3个月的时间内，对NS-GNDP的含量均匀性、储存稳定性和体内药物动力学试验进行评价，并与常规GNDP在室温下进行比较。结果表明，根据中国药典（2015​​）的标准，NS-GNDP的剂量单位均匀性是可接受的。使用光子相关光谱（PCS）、zeta;电位测量和扫描电子显微镜（SEM）系统地研究NS-GNDP的物理稳定性。在贮存3个月后，从NS-GNDP再分散的HL-NS的颗粒和PI轻微增加，这表明与新配制的NS-GNDP相比，NS-GNDP在4含有HL-NS后良好的再分散性。此外，对NS-GNDP的化学稳定性进行了研究，结果表明，与GNDP相比，HPE和HPN的降解更少，在储存3个月后提供了99％以上的药物残留。在体外溶出试验中，与GNDP相比，NS-GNDP的溶出速度显著增加，在3个月内没有明显的溶出差异。药代动力学的研究显示，与常规GNDP相比，NS-GNDP中的HPE和HPN表现为AUC_0–t和C_max显著增加，T_max下降。这些结果表明，NS-GNDP具有较好的的储存稳定性和增加的溶解速率和口服生物利用度的优势。

[关键词]肝能滴丸；木脂素；波棱瓜子；纳米混悬剂；稳定性；口服生物利用度

介绍

波棱瓜子是一种优良的民间药物，它是波棱瓜^[1]的干燥成熟种子，在西藏被广泛用于肝病、胆固醇病和消化不良症的治疗^[2-3]。在之前的化学研究中，大量的木脂素从波棱瓜子中分离鉴定^[4-6]，其中HPE和HPN（图1）被认为是具有显著抗乙肝病毒和肝保护作用的主要活性成分^[6-7]。但是，HPE和HPN难溶于水，导致药物口服生物利用度差，因此限制了其应用。考虑到这两种成分的进一步药物用途，已经生产了第五类新中药，肝能滴丸（GNDP）中含有HPE和HPN组成的木脂素（HL），并进行了随机临床试验，在乙肝病毒抑制试验中呈阳性反应^[8]。尽管如此，还有一个不可避免的问题：虽然滴丸的应用增加了HL的溶解度，但是GNDP的药物生产仍然有限，主要是由于滴丸的稳定性问题^[9]。

图1 herpetrione（A）和herpetin（B）的结构

滴丸是通过熔融法，溶剂法或熔融溶剂法制备的，固体基质中有一种或多种活性成分的固体分散体，其主要存在于分子、胶体或微晶体中并且可有效提高难溶性活性成分的生物利用度^[10]。然而，在长时间储存​​后，随着溶剂蒸发或基质浓缩后，基质溶解药物的能力下降，滴丸剂中的药物会部分沉淀，从而降低药物的溶解度、生物利用度和固有功效^[11]。因此，药物开发需要新的技术。最近，与基质结合的表面活性剂如月桂基硫酸钠/聚山梨醇酯80^[12]、月桂酸聚乙二醇甘油酯44/14^[13-15]和泊洛沙姆407^[16]已被用于制备固体分散体，目的是增加固体分散颗粒的可湿性以及药物和基质混合物的流变学性质，从而抑制药物沉淀并提高体内生物利用度。然而，在先前的实验中，我们观察到许多有趣的现象：在GNDP制备过程中，许多大颗粒不能完全溶解，而HL原料分散在基质中。奥斯特瓦尔德熟化现象表明，越小的颗粒越小，越大的颗粒逐渐长大。确定在滴丸中长期储存期间沉淀的大颗粒是否主要由未溶解的药物颗粒引起是有意义的。如果是的话，最迫切需要解决的问题是药品的颗粒大小。

在过去的几年中，纳米悬浮液（NS）已经成为将活性药物成分的粒径减小到纳米级（通常为200 nm～500 nm）的有前景和有效的方法^[17]。纳米颗粒可以增加表面积与体积的比值，从而更好地与周围的水介质相互作用以改善溶解度^[18]。除了更好的溶解性和更高的溶解速率，对于水溶性差的药物，NS还有其他一些优点，如载药量高、辅料的副作用发生率低和低成本^[19]。此外，NS制备技术相对简单，NS可以通过自上而下、自下而上的过程或两种方法的组合来生产^[20-22]。因此，在GNDP中使用NS来填充HL原料是一种提供均匀和小颗粒的潜在策略，同时最小化聚合物载体颗粒的变化，获得稳定的GNDP。

本研究的目的是通过将HL转化为HL-NS来提高GNDP的稳定性和口服生物利用度。HL-NS采用高压均质法制备；液体HL-NS通过冻干技术转化为固体HL纳米颗粒以制备新的NS-GNDP。通过采用光子相关光谱法（PCS）研究了NS-GNDP在储存3个月后再分散的HL纳米颗粒的粒度分布，并使用扫描电子显微镜（SEM）表征了所制备的NS-GNDP。对内容的均匀性和稳定性也进行了测试。为了验证包含HL纳米颗粒的NS-GNDP的优点，还研究了其溶出性质和药代动力学分布。

材料和方法

化学品和试剂

在Dr. YUAN(中国北京302军事医院)的实验室中制备了两种HL的混合物，包括HPE(纯度高达67%)和HPN(纯度高达31%)；十二烷基硫酸钠（SDS）和聚乙烯吡咯烷酮（PVPK-30）购自BASF Corp（德国Ludwigshafen）。PEG-4000和PEG-6000来自广东光华科技股份有限公司（中国广东）；高效液相色谱（HPLC）级乙腈购自Fisher（Fair Lawn，NJ，USA）。本研究中使用的所有其他化学品均为市场上可买到的分析级。

HL粗悬浮液（HL-CS）的制备

通过分散HL制备HL粗悬浮液，在含SDS（0.2％，W/V）和PVPK-30（0.3％，W/V）的含水表面活性剂溶液中加入原料HL（1％，W/V），然后用磁力搅拌器（SH-2，北京金贝德工贸有限公司，北京，中国）搅拌得到均匀悬浮液^[23]。

HL纳米悬浮液（HL-NS）的制备

HL-NS是通过高压均匀化^[23]制备的。制备流程为：将如上得到的HL粗悬浮液被高剪切均质机（Ultra-Turbx^reg;T25，IKA，Staufen，Germany）在12000 r·min^-1下剪切5分钟以形成均匀系统。接着，借助于活塞间隙高压均化器（EmulsiFlex-C3，Avestin Inc.，Ottawa，Canada）在高压下均化HL粗悬浮液。作为一种预铣削参数，在500 bar下进行5次循环，然后在1000 bar下进行20次循环以获得HL-NS。

冻干

通过冻干法，将HL-CS和HL-NS进行干燥，使其更好地加工成GNDP。首先，将新鲜制备的样品在-80℃预冻24小时（DW-86L388，青岛海尔股份有限公司，青岛，中国）。然后将冷冻样品使用冻干机（FD5系列，Gold SIM，北京，中国）在-50℃和0.10 mbar下冷冻干燥72小时，直到生成HL纳米颗粒和HL物理混合物。

含有HL纳米颗粒（NS-GNDP）、物理混合物（CS-GNDP）和粗粉（GNDP）的GNDP的制备^[24]

通过熔融法制备含有NS-GNDP、CS-GNDP和GNDP的GNDP。图2显示了制备GNDP、CS-GNDP和NS-GNDP的示意图。分散冷冻干燥的HL纳米颗粒后，将HL物理混合物（3g，相当于2 g HL）和HL原料（3 g）分散到熔融的基质（7 g，由2 g的PEG 4000和5 g的PEG 6000组成）中，分别以每分钟40滴的恒定速度将混合物加入装有二甲基硅酮的滴丸机中，恒温4℃。最后，用滤纸擦拭收集的滴丸，以除去表面二甲基硅酮。

NS-GNDP剂量单位均匀性分析^[25]

测量NS-GNDP、CS-GNDP和GNDP的权重，并求出平均值。分别使用10批样品测试NS-GNDP、CS-GNDP和GNDP各剂量单位的均匀性。HPE和HPN的含量通过HPLC测定。根据中国药典（ChP 2015），制剂的合格价值（AV）低于15.０％。通过以下公式计算CP2010的AV。(1)：

AV=︱M-X︱ ks (1)

其中M是标签声明（100％），X是单个内容的平均值（％），k是可接受常数，s是标准偏差。

在USP27中，制剂中主要成分的含量应在85～115％的范围内，相对标准偏差应小于或等于6.0％。

物理稳定性分析

将配制的NS-GNDP，CS-GNDP和GNDP在室温下储存在密闭的玻璃容器中3个月。在储存0、1、2和3个月后分别测定粒径、PI和SEM。

粒径和zeta;电位测量

应用激光粒度分析仪（Winner 801，Jinan Winner Particle Instrument Stock Co.，Ltd.，济南，中国），通过PCS测定了从NS-GNDP再分散的HL纳米颗粒的粒径和PI。为了评估再分散性，将10批NS-GNDP分别放入适量的蒸馏水中并轻轻摇动以获得用于PCS分析的合适浓度。通过采用电泳迁移率的方法，在用蒸馏水稀释后，在25℃下借助Zeta-sizer（3000SH，Malvern Instruments Ltd., Malvern, UK）分析zeta;电位。在粒径分析中，重复三次取平均值。

扫描电子显微镜检查法

利用SEM（S-4800，日立技术公司，日本东京）观察了NS-GNDP中的HL纳米颗粒的形态和分布，并与CS-GNDP和GNDP进行比较。在检查之前，使用双面胶带将NS-GNDP、CS-GNDP和GNDP的横截面直接固定在一个金属桩上，而将HL原料、冷冻干燥的HL纳米颗粒滴在硅片上并且使用双面胶带将其安装到金属桩上。在分析之前，这些样品在10 mA下镀金20 s，并用溅射镀膜机（SBC-12，KYKY technology Co., Ltd., Beijing, China）在真空中重复6次。表面形貌分别为15 kV和5 kV。

化学稳定性分析

在储存0、1、2、3个月后，使用5批相同重量的样品分别测试NS-GNDP、CS-GNDP和GNDP样品中的HPE和HPN含量。将这些滴丸溶解在25 mL甲醇中并超声15分钟。接下来，立即通过0.45 mu;m 微孔过滤器过滤溶液，并将20 mu;L最终样品注射到HPLC系统上进行分析。

体外溶出分析

在储存0、1、2、3个月后，分析NS-GNDP、CS-GNDP和GNDP的HPE和HPN的溶出率。根据CP XC桨法，使用溶出装置（RC-8，天津国明医疗设备有限公司，天津，中国）进行溶出度试验。选择200 mL磷酸盐缓冲液作为溶出介质，保持温度为（37 plusmn; 1）℃，搅拌桨转速为100 r·min^-1。在预先确定的时间间隔（2、5、10、15、20、30、60、90、150、270分钟）中，使用配备的注射器取出1 mL样品并立即通过0.45 mu;m的微孔滤膜过滤。同时，取样后立即补偿等体积的空白介质。通过HPLC测定样品溶液中溶解的HPE和HPN的量。所有的操作重复三次，取平均值plusmn;标准偏差。

大鼠药代动力学研究

体重180～220g的健康成年雄性Sprague-Dawley大鼠由军事医学实验动物中心（中国北京）提供。将这些大鼠随机分成三组（每组n=6），并在标准实验室条件下（22 plusmn; 2℃，相对湿度60％ plusmn; 5％）饲养至少3天。根据“实验动物管理原则”和“实验动物护理和使用指南”，提供食物和自来水。在实验中遵循302中国军事医院动物护理和使用委员会批准的方案。在实验之前，将大鼠禁食过夜并可自由饮用自来水。第二天，将分别贮存0、1、2、3个月后的NS-GNDP、CS-GNDP和GNDP的制剂分散在4mL水中，分别口服。每个制剂的HL当量剂量为75 mg·kg^-1。对于药代动力学分析，在给药后的预定时间（0.083，0.167，0.33，0.5，1，2，3，4，6，8，10和12小时）后，用毛细管穿刺从眼眶窦静脉穿刺，收集约0.5 mL的血样，并保存在肝素化的管中。立即通过离心机（H

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