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金纳米颗粒的光热效应对拟南芥的影响

Yeonjong Koo，Ekaterina Y.Lukianova-Hleb，Joann Pan，Sean M.Thompson，Dmitri O.Lapotko，and Janet Braam*

金纳米粒子（GNPs）的光热效应在生物学反应中已经得到了应用和展示，除了一个重要的种类--植物。本文中，让拟南芥根摄取金纳米粒子后，在植物中成功的检测到了等离子体纳米气泡的生成和根对叶的信号传输。 此外，拟南芥摄取金纳米粒子并暴露于连续的激光或非相干性光后，叶片表面温度升高并且诱导表达了热休克调控基因。 总体而言，这些结果表明拟南芥可以通过根部吸收金纳米颗粒并将颗粒转移到叶组织。一旦在叶内，金纳米颗粒可以作为可遥控的光热剂活化植物中的局部生物过程。

1. 介绍

金属等离子体纳米颗粒是通过表面等离子体共振作用的稳定的光热转换器。这种独特的机制使得在包括生物医学应用中能够精确地处理纳米级的热能。在固定光学激发下，金属纳米粒子通过热扩散产生局部热，金属纳米微粒产生等离子体纳米气泡，膨胀和塌陷的气泡，可以对生物组织产生机械冲击。在金属纳米粒子中，金胶体有最佳的生物相容性，因此已被广泛应用于各种生物医学研究和临床试验。虽然存在广泛的生物医学应用，金纳米颗粒（GNP）的光热现象在植物生物学的实际应用尚不明确。金胶体在根系统中有安全性，对植物来说易于处理，给植物应用带来许多有趣的机会。因此，我们研究了金胶体在良好的植物模型--拟南芥中的平稳和非平稳光热效应的潜力，并检查了金纳米颗粒摄取和光热活化生物反应。

1. 结果

2.1金纳米颗粒可以在拟南芥叶中的等离子体纳米气泡中检测到

确定植物组织中GNP的检测条件，通过下（背）表面将拟南芥叶片中一ppm（= 4.8times;10⁸ GNP mL^-2）60nm GNP直接注入到拟南芥叶中，并且将一个532nm 70 ps持续时间和140 mJ cm^-2的光照影响应用于同一区域。 这些初始条件是基于以前检测水中各个60 nm GNP周围的等离子体纳米气泡的选择（图S1）。叶组织中等离子体纳米气泡的阳性信号与无GNP的对照叶的背景信号明显区别（图S1）。

2.2金纳米颗粒通过血管组织分布于叶中

为了测试GNP是否可以被血管组织吸收到拟南芥叶中，从植物中分离出成熟的叶，叶柄浸没到有GNP和没有GNP的培养基中。 暴露5小时后，通过激光扫描分析叶片。 光束直径为0.1 mm，每0.5 mm施加一次，影响约12.5％的叶面积。 我们优化条件，使用20 ps持续时间的532 nm光影响281 mJ cm ^-2，并发现大部分（99％）的信号幅度降至90 mV以下，主要峰值为75 mV（图S2）。 因此，在GNP检测分析中，仅使用90 mV及以上信号作为上述背景数据。

图1。（A-C）定量声信号幅度（以mV表示）以轮廓线显示在叶片摄影图像上。将叶柄暴露于培养基的对照叶片（A）与缺少GNP的（B），其中（C）显示从根部暴露于50ppm GNP 5小时的完整拟南芥的叶。

为了分辨GNP的空间分布，我们将声信号映射到分析叶片的图像上（图1）。 如图1B所示，将叶片暴露于含有50ppm GNP的培养基中5小时，在超过15％的扫描位点显示出强大的（ge;90mV）的声信号。 类似地处理但没有GNP暴露的对照叶仅显示背景信号（图1A）。 在GNP处理的叶中检测到的大多数（ge;90％）信号的幅度在90和200 mV之间（图2A）。

在GNP处理的叶中检测到的等离子体纳米气泡特异性信号与在水中和无GNP植物组织背景下的单个GNP产生的相当。 由于检测到的声信号的振幅与气泡大小相关，我们得出结论，通过该方法可以在植物中检测到单个60 nm的GNP。 使用这种方法，可以快速获得GNP检测数据，避免了痕量金属分析或电子显微镜通常需要的特殊方案、试剂和制备时间。

2.3拟南芥通过根吸收金纳米颗粒并转移到叶中

虽然有一些有限的证据表明完整的植物根系可以占据和转移纳米颗粒，但仍然存在一些争议，GNP与完整拟南芥的相互作用尚未得到证实。为了评估GNP摄取和转移，我们将4周龄的水培生长的拟南芥转移到含有GNP的生长培养基上，并且在暴露5小时后，用单独的532nm光（20ps，281mJ cm^-2）扫描叶子。类似于叶片直接浸入含有GNP的培养基（图1B）中，GNP暴露5小时的植物叶子，在整个叶片上都显示出强烈的等离子体纳米气泡特异性声信号（图1C），表明GNP是很容易被根吸收并转移到叶上。因为总体分布模式和信号强度分布是相似的，无论GNP的摄取是通过叶或根系（图1B，C）。这些结果表明，60 nm的GNP可以通过拟南芥根系被吸收并通过血管系统移位，这表明这种大小的颗粒不会阻碍木质部输送系统。了解GNP如何通过根细胞层传播将是未来的一个研究方向。

图2。从拟南芥叶中GNP检测到的声信号的统计分析。 A，B）叶片信号幅度的频率在A）高和低的GNP浓度暴露于分离的叶柄和B）高和低的GNP浓度暴露到整个植物。 信号幅度低于200 mV，高于200 mV，均表示在每个图表的上方。C）发射可检测信号（表面信号，x轴）和声信号振幅（平均信号幅度）的叶面积百分比绘制来自（A）和（B）的90mV以上的平均信号振幅低于90mV，y轴）。 独立叶数据以绿色显示; 曝光数据显示为橙色。

植物具有聚集形成纳米粒子的金属离子的能力。为了评估在拟南芥组织中GNP是否聚集成簇，我们比较了高（2.4times;1010 NP mL^-2 ）和低（4.8times;108 NP mL^-2）GNP浓度暴露于培养基的拟南芥叶的叶声信号分布。高GNP浓度的等离子体纳米气泡特异信号的叶表面积百分比从18％提高到25％（图2C），但几乎所有信号保持在90-200 mV幅度范围内（图2A， C）。因此，更大的GNP浓度导致GNP吸收增强，但不会增加高幅度检测信号的频率。缺乏高幅度信号表明GNP在植物中没有聚集。从根暴露于GNP的植物的叶子获得了类似的结果（图2B，C和图S3）。生长介质中较高浓度的GNP导致叶表面发射等离子体纳米气泡特定声学信号的百分比增加（从7％到14％）（图2B，C），但是信号的最大振幅没有显著影响（图2B，C）。与高浓度GNP相比，时间较长，导致叶表面信号达24.5％，但信号幅度仍没有显著影响（图S3，B）。在所有实验条件下，包括通过叶柄直接GNP吸收，超过200mV的强信号少于总阳性信号的23％（图2A，B）。检测点主要位于叶静脉附近或靠近叶缘（图1B，C）。总体而言，这些结果表明，GNP通过了拟南芥具有5-25mu;m的木质部血管，并且趋于保持不分散。得出了荧光纳米颗粒的植物摄取和易位的相似结果。

不论GNP是通过根还是叶柄引入，GNP定位在叶片中的相似性与从根中颗粒通过血管系统移位而非从细胞到细胞的解释一致。 此外，这项工作表明，GNP在植物组织中相对稳定，没有聚集倾向，因为检测到的近90％的GNP都具有与单个颗粒一致的信号。

2.4叶片的热成像

因为GNP与光的相互作用可以产生热量，所以我们检查了光是否可以用于通过GNP相互作用触发局部热产生。 首先，使用热敏成像，我们比较叶片在具有或不具有GNP的培养基中培育的叶片的温度，并暴露于三种不同激光辐射强度的瞬态（60s）532nm激光。 如图3所示，用GNP预处理的叶片与缺乏GNP的叶片相比显示出更高的温度。 温度变化广泛分布在叶面附近，叶中部附近的强度最大。 这些结果表明，纳入叶中并通过连续激光激发60秒的GNP可以通过将吸收的激光能量转换成热量来增加组织温度，产生可检测的光热效应。

图3。检测GNP依赖激光诱导温度。 A）假彩色图像在具有或不具有GNP的介质中，通过34,23或11mW cm^-2激光60秒之后用热敏照相机获得。 B）最大叶绘制作激光光强度函数的温度。实（红色，橙色和黄色）线和虚（蓝色）线表示GNP处理和未处理的叶子（n = 6）。GNP暴露的最大叶片温度的显著差异是在激光曝光30秒后，光强度23和34 mW cm^-2（p lt;0.05）。没有显着差异发现在11mW cm^-2的激光强度。 C）暴露于不同GNP浓度后随时间推移的最大叶片温度。 D）百分比叶面积，温度超过24°C，30秒激光处理。 E）GNP依赖热产量叶片暴露于非相干光源，荧光灯泡，阳光或金属卤化物灯。叶柄浸没在1/16强度的Hoagland溶液中以防止脱水;四叶为非GNP-处理的对照组和四个叶片预处理至10ppm GNP 24小时。2.2 mW cm^-2的荧光灯强度（第二面板），15mW cm^-2的太阳光强度（第三面板）和2.2mW cm ^-2的金属卤化物灯光强度的假彩色热图像。

为了定量比较激光诱导的温度变化并评估温度变化与激光辐射强度的函数，我们测定了在GNP处理的和GNP未处理的叶片在不同激光条件下随时间获得的最大激光诱导温度（图3B）。光强度越高，在对照和GNP处理的叶中检测到的热发射越大（图3B）。 没有GNP的激光也足以提高叶片温度，表明单独的光能量产生的热量超过了蒸发叶片冷却的阈值，其中最大的温度变化发生在激光曝光的第25个周期。 虽然GNP的叶片温度在34 mW cm^-2时达到最高，但是在23 mW cm^-2处观察到最大温差（图3B）。

我们接下来比较了激光辐射恒定强度（23 mW cm^-2）下增加GNP浓度对激光诱导叶片温度的影响。 在较低GNP浓度（1 ppm）下，激光照射时的热辐射无明显影响，而10ppm的GNP足以引起明显的激光诱导温度变化，而高（25ppm）GNP（图3C）则无进一步增加。 温度（即大于24℃）的总体比例对于暴露于10或25ppm GNP的叶子而言，与不含GNP并入的对照叶相比，显著升高（图3D）。 因此，通过GNP的存在，达到的激光诱导温度峰值和叶片区域的温度变化程度均得到提高。

2.5非相干光照射对GNP处理植物叶的光热效应的影响

我们试图确定暴露于环境光源（例如自然阳光或人造光源）的GNP处理植物是否也会响应由于GNP依赖的光能转换为热量而导致的高温。因此，我们比较了在接触荧光，阳光或金属卤化物灯后，从对照叶到GNP处理的叶的温度读数（图3E和图S4。将分离的叶柄置于1/16强度的Hoagland溶液液滴中以保持蒸腾并防止组织干燥;因此，叶柄和近端叶片在热敏摄影机图像中保持相对较冷并且是假蓝色的（图3E和图S4）。在低（0.22 mW cm^-2）或高（1.1-2.2 mW cm ^-2）强度荧光下，GNP处理叶和对照叶无明显差别（图3E）。缺少GNP效应可能是因为荧光灯泡在绿色波长中较弱，这激发了GNP（图S5）。为了测试阳光对叶片温度的影响，保持凉爽的环境室温为23°C，分离的叶子通过玻璃在中午暴露于阳光下。在这些条件下，一分钟暴露于中度云层（6.6 mW cm^-2）或无云层（15 mW cm^-2）的阳光下，导致GNP远端部分的最高温度读数高达0.5°C （图3E和图S4），我们也测试了金属卤化物光照，因为这些灯在绿色光谱中强烈发射（图S5）。金属卤化物灯在23摄氏度的光照下，在高强度（超过2 mW cm^-2）但不低于光强度（低于1.7 mW cm-2）的对照叶中，GNP处理的叶片的温度升高显着（图3E和图S4D）。因此，非激光也足以导致GNP介导的热产生。

图4

2.6拟南芥叶组织对固定光热影响的生物反应

为了测试在GNP处理的叶片中检测到的光诱导温度是否具有生物活性，我们检测了已知高温诱导的植物基因的表达水平的变化。 与对照叶，GNP处理的叶或激光处理的叶相比，HSP17.4和HSP90的转录水平均显着高于对照叶，相比GNP处理的叶或受激光处理的叶（图4），HASP17.4的转录水平增加三倍（图4A）。 因此，可以通过负责HSP17.4和HSP90基因表达调控的细胞通路检测对GNP的激光诱导光热作用的生物反应。

表一。对比GNP与无GNP吸收拟南芥叶片最高温度。 *表示重要。

激光曝光的GNP的光热效应仅限于与GNP紧邻的区域，因此我们接下来寻求获得植物基因表达响应的空间。作为观察局部基因表达变化的工具，我们采用携带编码beta;-葡糖苷酸酶（GUS）基因融合的HSP17.4的1kb启动子区的转基因植物。将来自P_HSP17.4-GUS转基因植物的叶子暴露于10ppm GNP 24小时，然后经受23mW cm^-2的连续激光1.5小时（120Jcm^-2）。为了比较，将另外的转基因叶在高温（37℃）下培育1.5小时。未经处理的转基因叶片在染色时仅显示轻微和局部的蓝色，而暴露于37℃的转基因叶片在整个叶上呈色（图4B）。在中央静脉区域缺乏

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