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用于癌症治疗的可代谢的高分子纳米量子点

Fuyao Liu,, Xiuxia He, Hongda Chen, Junping Zhang1, Huimao Zhang4 amp; Zhenxin Wang

摘要

小的流体动力学直径是纳米粒子能否从人体内通过肾脏排出的关键因素。然而，合成一种具有诊断和治疗作用的超微纳米颗粒依然是存在挑战的。在本研究中，在温和条件下通过基于Fe³ ，GA和PVP配合反应这种简单可行的方法来合成具有pH活性的纳米配合物。Fe-CPNDs表现出极小的流体动力学直径（5.3 nm）和电中性的表面。Fe-CPNDs也展现出来能被pH活化的核磁共振成像衬度和接触的光热响应性能。Fe-CPNDs的这些特点极大的增长了肿瘤细胞成像灵敏度，促进注射后模型动物体内肾脏清除。核磁共振成像引导的光热效应完全抑制了肿瘤的生长。这些发现证明Fe-CPNDs构成了一种新的肾脏可清除的纳米颗粒用于光热能谱分析和核磁成像。

前言

治疗学纳米药物领域的近期发展通过提供个性化药物提高了我们提供高质量生活和患者存活率的能力^[1-5]。因为它们可协调的物理化学特性，许多无机、有机的纳米颗粒，包括碳纳米管，金属纳米颗粒和脂质体都能被合成应用于疾病的检测和药物的传输^[6-9]。特别的，基于高分子配合的纳米颗粒（也被称作纳米尺寸的金属有机配合物或者纳米级的金属有机框架）被认定在纳米药物方面有可观的前景。因为无机有机的纳米颗粒都展现出吸引人的优势。例如相对规律的形状，硬质，多样性的组成，生物降解性和表面易于功能化^[10-12]。举个例子，Lin等人报导他们自己合成的纳米级锌二磷酸盐高分子配合物平台，被设计用作在肿瘤细胞中有选择性的吸附铂和奥沙利铂^[10]。

大部分的纳米颗粒都有一个问题，在体内器官（如肝和脾）中有高的吸收率，导致纳米颗粒只能缓慢低效从体内代谢排出^[13-15]。然而，通过美国食品药物安全监管局的指导方针，任何显像剂（进入到身体里面）应该能在一个合理的时间段内完全的排除身体^[16]。纳米颗粒过长的停留时间会增加他们致毒的可能性。通过肾脏直接将纳米颗粒排到膀胱可以解决这个问题，因为肾脏清除比肝要快^[16-20]。因为肾小球独特的毛细血管壁使得只有极小流体动力学直径的纳米颗粒才能穿过肾^[17,19,20]。高价阴离子和阳离子都能在血液中吸附血清蛋白质或其他物质，使得颗粒直径明显的增加^[16-18]。因此制备肾脏可清除的并且具备满意的多功能的高分子配合物纳米颗粒依旧存在挑战。然而，在临床应用中肾脏清除是一把双刃剑。纳米颗粒副作用和毒性需要减小，但是减小纳米颗粒在癌症细胞的保留时间削弱了分子成像灵敏度和治疗效果。因此，纳米颗粒必须满足在成像和疗效要求的同时满足肾脏在合理的时间内能清除纳米颗粒^[16,19,21]。例如，在纳米颗粒存在高峰时段2-4小时内进行核磁共振成像，就可以满足临床治疗的基本要求^[22]。

几个能够最大化样品信号并能同时降低背景信号的智能的纳米系统已被设计成对特异性的生物刺激具有响应性的体系^[23-27]。因为酸中毒是硬质癌细胞的一个显著的特征和普遍的现象，所以肿瘤细胞的pH环境是一个探究这个观念最具有前景的刺激^[28]。例如，Gao和其他作者建立了一系列对pH极度敏锐的肿瘤细胞外环境和肿瘤血管^[27]。因此，介绍超小型有着治疗功能的能被pH活化的纳米颗粒是极具价值的，因为这些纳米颗粒提供了在生物医学应用上更多灵活多变的方式，例如治疗学和诊断。

在本研究中，超小尺寸的PVP-Fe³ -GA高分子配合物纳米点（Fe-CPNDs）可以通过一个简单可行的方式用无害的材料合成。Fe-CPNDs的直径小至5.3nm，表面呈电中性，并且展示出杰出的光热响应性能和高稳定的胶体性质。在动物体内实验中证明Fe-CPNDs通过增强渗透作用在癌细胞位点积累、保留。并且在尾静脉注射24小时后能完全被肾脏清理。这些特性都能复合临床需求。并且，被pH活化的Fe-CPNDs的核磁共振成像对比图表现出非常好的性质。Fe-CPNDs有效的消除了体内的肿瘤细胞，以Fe-CPNDs在癌症治疗上作为肿瘤细胞成像探针具有临床应用的前景。

结果与讨论

Fe-CPNDs的合成表征

我们报导了一种简单高效的方法一步合成形态大小可控的酚醛组金属离子配合物。这种方法的原理在于GA 和Fe³ 分别作为有机配合物和无机交联剂。Fe³ 比其他顺磁性的金属离子（比如 Mn² 、Cd³ ）有更低的生物毒性。GA是一种小分子量的茶多酚，可以与Fe³ 反应生成稳定的GAn- Fe³ (nlt;=3）配合物通过形成酚盐羧酸盐的Fe³ 配位键。在一定的外界温度下，PVP与Fe³ 在水中混合能立即生成PVP-Fe³ 混合物^[29,30]。在PVP-Fe³ 混合物的水溶液中加

图1.合成与表征Fe-CPNDs.(a)Fe-CPNDs的合成示意图.(b)TEM显微图（标尺，20nm）.(c)高分辨率的Fe-CPNDs显微图（标尺，5nm）.(c图)Fe-CPNDs相应的FFT模式(d,e)Fe-CPNDs的AFM成像.(f)高剖面下的Fe-CPNDs的AFM成像AFM成像.(e)

入GA，会在GA与Fe³ 接触的地方产生反应位点，生成CPNDs。PVP也在CPNDs成核长大过程中起保护作用。因为PVP的氨基和Fe³ 配合在一起，因此PVP可以使纳米点具有稳定的空间结构。XPS，红外光谱和拉曼可以证明PVP与Fe³ 有弱相互作用。PVP配合Fe³ 后，酰胺中O中1s能谱会从530.5eV迁移至531.4eV。可以证明PVP与Fe³ 的相互作用。FTIR谱图可以展示1670cm^-1出（PVP酰胺单元C=O伸缩）和~1670cm^-1出的肩峰（图2），后一个肩峰的形态表明PVP的酰胺与Fe³ 结合^[29]。在PVP-Fe³ 的拉曼光谱中，1600cm^-1处可以清晰的观察到一个新峰，进一步证明PVP与Fe³ 之间的相互作用（图3）。如预期的，我们成功的得到了单分散的Fe-CPNDs。X射线吸收精细结构分析，在Fe-CPNDs中Fe主要以三价的形式存在，一个铁原子与六个氧原子相互作用。在合适尺寸的微粒中几乎不存在缺少PVP，Fe³ 或GA的现象。这个结果证明了Fe-CPNDs的合成可以在简单的设备环境条件下进行。另外，合成材料也是现成的，便宜的。美国食品药物安全局认定的安全品。例如，GA是一种植物提取物，通常用于制药工业^[31-33]。PVP因其无毒性，中性pH，长时间的血液循环在重要器官中的低累积量而被用作在NP-based中的理想造影剂^[34]。Fe-CPNDs可以通过增大反应物用量来成功的扩大反应规模，在重复多次的干燥，溶解的过程中，Fe-CPNDs水溶液的粒径保持不变。结果表明了这个方法有着适合工业化的优点。已制备的Fe-CPNDs是平均直径为1.49plusmn;0.21 nm，大小分布较为集中的球形颗粒。在高分辨率透射电子显微镜下Fe-CPNDs表现出低衍射并且没有明显的晶格条纹。证明纳米点是非晶体。Fe-CPNDs的大小形态被原子力显微镜表征，Fe-CPNDs是球形纳米点，平均直径为1.51plusmn;0.19nm。在水溶液中Fe-CPNDs比较小，约为5.3nm，在PBS缓冲液和血清中都能满足肾清除颗粒直径的阈值^[16-20]。水溶液中的颗粒直径高于纳米点直径取决于高真空下的TEM。因此，外层PVP明显的增加了Fe-CPNDs水溶液的直径。考虑到PVP（分子量=8000）在水中的直径约为2nm，在DLS的观测结果中可以明确有一层无序的PVP链包裹在Fe-CPNDs外。Fe-CPNDs在不同溶剂中的Zeta电位如表2.在所有的分散剂中Fe-CPNDs都表现出良好的溶解性。接近中点Zeta电位说明Fe-CPNDs的表面包裹了一层相应的非离子水溶液PVP链。PVP包裹层的存在使得Fe-CPNDs在不同的分散剂中稳定存在，包括H₂O, PBS, TB, 0.9% NaCl溶液和DMEM 10%牛胎儿血清。X射线弥散能谱也能证明Fe-CPNDs中有铁的存在。XRD进一步说明了Fe-CPNDs是非晶体结构。红外中Fe-CPNDs在1250cm^-1处（HO-C伸缩振动）比GA的低，证明GA中HO-C有一部分与Fe³ 配合。Fe-CPNDs的FTIR谱图中2955cm^-1（C-H伸缩振动）和1654cm^-1(C=O)进一步证明量子点中PVP的存在^[35]。

Fe-CPNDs的核磁共振

测试Fe-CPNDs纵向（r₁）和（r₂）横向弛豫可以测试Fe-CPNDs作为T₁ MRI造影剂的可能性。Fe-CPNDs r₁和r₂的弛豫系数分别是1.5和2.9 mM^-1 s^-1，和报导的造影剂相当^[36-38]。r₁和r₂/r₁的值表明Fe-CPNDs可以用作高效T₁ 造影剂^[39]。通过增加溶液的pH值增加TA在Fe³ –TAn中配合数（pH lt; 2, pH = 3-6, pHgt;7时分别以Fe³ –TA，Fe3 –TA2，Fe³ –TA3 为主要成分）^[40]。此外，

图2.Fe-CPNDs核磁共振的对比效果.(a)Fe-CPNDs作为Fe³ 摩尔浓度函数在水溶液中的R1/R₂弛豫效应.(b)Fe-CPNDs在R1弛豫效应下Fe3 在不同pH下不同浓度摩尔函数.(b插图)以及相对应的Fe-CPNDs在不同pH值下的核磁共振图。

GA是TA的单体，因此GA也可以形成pH控制的配合物。例如，在生理环境中三个GA可以和一个Fe3 反应生成稳定的Fe3 -GA3。但是Fe3 -GA3在酸性条件下会逐渐分离。Fe3 –GAn最后会由三价配合物转化为二价配合物。在弱酸性条件下配位数的减少会增加在顺磁性Fe周围的第一第二球形空间内的配合水的数量和可移动性，从而进一步提高弛豫系数。不同温度下的红外谱图指明了分解处于pH 5.0的Fe-CPNDs比处于pH 7.4的能吸附更多的CO。表明Fe-CPNDs在pH5.0 Fe³ 含有更多的活性位点。如预期的，当我们将pH从7.4调整到5.0的时候，我们可以观察到r₁的值从1.4mM s^-1变到了1.9mM s^-1。被pH活化的MRI对比表明其有利于癌症肿瘤的检测。例如，Fe-CPNDs的形貌可以很好的证明肿瘤的位置，因为肿瘤组织通常比正常组织更偏酸性。在37℃下恒温一个计算期，Fe-CPNDs的吸光度和溶液的颜色会随着pH的减小而逐渐衰减。这个结果表明Fe-CPNDs会衰减。衰减后的产物进一步用高效液相色谱和FFT和XPS分析。溶液中游离GA的数量与反应时间成正相关与溶液pH值成负相关。Fe-CPNDs的XPS和FFT结果呈现了在降解后的细微的变化。结果表明，GA在弱酸性环境下逐渐分解，分解后的GA不会形成新的结晶相。

为了证明MRI的成像能力，在西门子1.5T核磁共振中Fe-CPNDs着色的SW620细胞颗粒T₁加权核磁共振谱图中聚集。核磁共振信号强度与Fe-CPNDs在培养媒介中的浓度成正比。这些核磁共振结果证明CPNDs有突出的标记功能，说明它们有潜在的分子核磁共振造影剂的功能。

因为pH可以控制Fe³ 和GA合成反应，Fe-CPNDs提供了极佳平台通过利

图3.体内异种移植结直肠肿瘤核磁共振图。裸小鼠结肠直肠体内核磁共振图(a)在尾静脉注射（箭头为注射位点）和(b)Fe-CPNDs尾静脉注射（肿瘤细胞，箭头;肝，椭圆）不同时间（0分钟和0小时表明预先注射）.(c)肿瘤相应的数据分析在a.(d)肿瘤细胞的相应数据分析，膀胱和肝脏在b.误差线表现在s.d（n=5, 剩余内容已隐藏，支付完成后下载完整资料

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