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氟化碳标记衍生技术结合氟固相萃取：一种新型高灵敏度、高选择性质谱分析聚糖结构

方法

摘 要：质谱法灵敏、选择性分析聚糖仍存在诸多挑战。这归咎为：首先，聚糖在复杂生物混合物中的丰度较低、疏水性低；其次，其他生物分子(如蛋白质、多肽等)或污染物会对聚糖检测产生抑制作用。这里，我们报道了一种新型基于氟化学的高灵敏度、高选择性的质谱分析聚糖技术。通过聚糖的还原端与疏水的氟化碳标记试剂进行衍生，我将聚糖在质谱中的离子化效率提高了一个数量级。更重要的是，我们通过氟化碳标记法与高效氟固相萃取(FSPE)技术，选择性地从污染溶液和蛋白混合物中富集了聚糖。最后，我们采用该新方法，成功地分析了人血清中的N-糖组。

1 引言

糖基化是真核生物蛋白质最普遍的翻译后修饰之一。聚糖即糖基化过程中形成的多糖，在众多生物进程中，如细胞的生长与发育、细胞内和细胞间的信号传导以及肿瘤的生长和转移，有着至关重要的作用。聚糖也是一种重要的疾病标记物，且与多种疾病，如癌症、炎症以及退行性疾病等密切相关。因此，聚糖检测是分析糖基化过程、了解糖基化功能的决定性的因素。目前，质谱法因高灵敏度和能提供构信息等优点，经成为聚糖分析的有效工具。然而，在复杂生物样品中聚糖中丰度低且易被其他种类的生物分子或污染物的信号所抑制，这极大地限制了聚糖在质谱检测中的灵敏度。另外，聚糖固有的亲水性且缺乏质子化的碱性位点也导致其离子化效率极低。

由于复杂生物样品中聚糖的丰度较低，因此在质谱分析前我们需要对聚糖进行富集。固相萃取(SPE)法现已广泛应用于聚糖的提取与纯化。其中，应用最为广泛的是多孔石墨化碳(PGC)和亲水作用色谱（HILIC）法，这两种方法对于聚糖都有一定的选择性。然而，在 分析复杂生物样品分析时，上述方法中聚糖和固相之间的相互作用相对减弱，对聚糖选择性降低，从而导致聚糖与其他生物分子(如蛋白质、多肽等)或杂质的共洗脱。

质谱分析聚糖前，为增强其疏水性、提高离子化效率，还需进行衍生化处理。常见方法有泛甲基化法、还原胺化法以及生成腙法。泛甲基化反应将聚糖的羟基和羧基转化为甲基基团，增强了聚糖的疏水性稳定了易丢失的唾液酸基团。然而，该方法湿化学反应步骤较多、反应效率相对较低，限制了其应用程度。还原胺化和肼化法通过衍生试剂与聚糖还原端的结合实现。其中，还原胺化法步骤简单、产率高且适用于众多伯胺类试剂，因而使用最为广泛。例如，为提高聚糖离子信号响应，2-氨基苯甲酰胺(2-AB)和2-氨基吡啶(2-AP)已广泛应用于聚糖衍生化中。但是，这类方法的主要缺点在于：衍生化反应引入了过量的衍生化试剂和缓冲溶液，从而干扰后续的质谱分析，因此需要在衍生化反应后必须进行纯化/富集步骤。

针对这些问题，我们尝试发展一种高灵敏度、高选择性的“一管式”聚糖分析方法，该方法应既能同时提高聚糖电离效率又能实现聚糖的选择性富集。因此，我们针对标记物设计了一种特定的标记物-聚糖衍生化方法以及相应的固相萃取技术。研究表明，全氟烷基化合物具有极化率低、疏水性高、化学稳定等性质，因此选用该类化合物来标记聚糖可提高聚糖的疏水性。此外，由于全氟烷基基团间存在偶极-偶极相互作用，这使得氟固相萃取技术(FSPE)能够把高度氟化的目标产物从非氟化合物中分离出来。基于氟化合物的独特性能优势，氟化学法已经应用于诸如蛋白质组学、代谢组学分析等生化应用中。在本文中，我们首次将氟化学法应用于N-糖组分析，结果表明该方法能实现复杂样品中N-聚糖的高灵敏度、高选择性分析。

2 实验部分

2.1 药品与试剂

麦芽七糖(DP7, 95%)：来自林园生化实验室(日本冈山)；

人体血清：来自上海中山医院一名健康志愿者；

右旋糖苷1000(分析纯，98%)：A1聚糖，来自卢德格尔(英国牛津)；

alpha;-氰基-4-羟基肉桂酸(CHCA)；三氟乙酸(TFA)；碳酸氢铵(ABC)；甲酸铵；胰蛋白酶(蛋白质组学级)；卵清蛋白(OVA)；牛血清蛋白(BSA)；氰基硼氢化钠(NaBH₃CN)；二氧化钛亲和吸头：来自西格玛奥德里奇(美国密苏里州圣路易斯)；

FluoroFlashNuTips和C₁₁H₈F₁₇N (HFUA)：来自氟技术公司(宾夕法尼亚州匹兹堡)；

多肽N-糖苷酶(PNGase F)：来自英格兰生物学实验室(美国马萨诸塞州伊普斯维奇)；

氯化钠(NaCl)：来自上海化学试剂公司(中国上海)；

色谱级甲醇(MeOH)和乙腈(ACN)：来自默克公司(德国达姆施塔特)；

分析纯乙酸(HAc)：来自国药集团化学试剂有限公司(中国上海)；

蒸馏水：由Milli-Q系统(美国马萨诸塞州米尔福德)纯化

2.2 从糖蛋白中制备聚糖

酶促去糖基化：将卵清蛋白溶于50mM pH=8.0碳酸氢铵缓冲溶液中，配置成浓度为2mg/ml 的溶液。然后用多肽N-糖苷酶溶液处理蛋白质溶液，在37^oC反应18h以释放聚糖。

血清样品制备：根据相关文献，在温和条件下使二硫苏糖醇变性。将样品与20mM二硫苏糖醇溶液等体积混合。将得到的包含聚糖、蛋白质和其他物质的混合物样品储存在-20^oC有待进一步使用。

聚糖的泛甲基化：将10mu;g DP7溶于0.5mu;l 水中，加到300mu;l 二甲基亚砜(DMSO)中，向其中加入30mg 氢氧化钠和5mu;l 甲基橙。室温下反应十分钟。

用氯仿萃取泛甲基化后的聚糖，并用水反复洗涤。烘干样品，并将其重新分散在50%乙腈水溶液中。

2.3 聚糖的氟衍生化

标准聚糖(DP7或右旋糖苷1000)和从糖蛋白制取的聚糖溶解在含有5%乙酸的50%乙腈溶液(体积比)中。并与HFUA反应(衍生化反应试剂与聚糖摩尔比为10：1)，然后加入还原剂氰基硼氢化钠(NaBH₃CN)。在65^oC反应2h。

2.4 氟的固相萃取

FluoroFlashNuTips内填满了含氟化碳的硅胶来富集氟化碳衍生物聚糖。NuTips预先用20mu;l 纯甲醇除尘洗涤三次以平衡色谱柱，然后用20mu;l含有10mM 甲酸铵30% 甲醇溶液洗涤五次。将标记样品溶解在含有10mM 甲酸铵20% 甲醇溶液中，并且注入色谱柱中。用含有10mM 甲酸铵的30%甲醇溶液和含有10mM 甲酸铵的60%甲醇溶液各润洗色谱柱5次，洗脱非特异性结合的蛋白质、多肽和盐。最后用纯甲醇溶液作洗脱缓冲液洗脱氟标记聚糖，然后烘干萃取物待进一步分析。

2.5 基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱分析

干燥后的洗脱液溶于50%乙腈溶液中，将1mu;l 样品涂在基质辅助激光解析电离板上，在空气中干燥。然后将1mu;l 基质(由5mg/ml alpha;-氰基-4-羟基肉桂酸溶解在含有0.1% 三氟乙酸的50% 乙腈溶液中制得)也涂在基质辅助激光解析电离板上，在空气中干燥后做质谱分析。基质辅助激光解析电离飞行时间质谱分析在5800蛋白质分析仪(美国马萨诸塞州，弗朗明汉应用生物系统公司生产)中正离子反射模式：355nm 钇铝石榴石晶体激光，400Hz 频率以及20kV 加速电压。激光能量的范围可以进行优化，设置为5500是为了下一步分析。用标准的肌红蛋白酶解得到的多肽，进行外部质量校准。用GlycoWorkbench软件来解析质谱数据并进行糖型分析。同时，我们通过比较之前研究的从糖蛋白或人体血清中提取的N-聚糖在色谱柱中的分配，证实了我们结果的正确性。

3 结果与讨论

3.1 通过氟化碳标记衍生化法电离效率的提高

表1.(a) 还原胺化法衍生麦芽七糖示意图

(b)氟固相萃取全氟衍生物及质谱检测

如表1所示，C₈F₁₇-功能化胺(C₁₁H₈F₁₇N, HFUA)不仅是一种典型的还原胺化聚糖的氟化衍生标记，而且还是一种亲和标记。因此，氟化聚糖仍保留在填满氟化碳硅胶的氟相NuTips中，而未衍生化物质(如：蛋白质、多肽和其他干扰物质)全都流出。最终质谱分析前洗脱氟化聚糖。

首先用简单的DP7作模型探讨衍生化反应。在衍生化之前，观测到DP7信号为碱金属加合物(DP7 Na) (m/z=1175.2)和(DP7 K) (m/z=1191.2)(支持信息 图S1a)。与HUFA衍生化之后，观测到氟化DP7出现了m/z=1636.3 ([DP7 HFUA Na] )、m/z=1652.3([DP7 HFUA K] )和m/z=1614.3 ([DP7 HFUA H] )的信号峰。当原本的DP7信号消失时，可以认为衍生化反应进行完全(支持信息 图S1b)。

图1 10pmol DP7和衍生化DP7质谱图

由于含有全氟烷基分子具有独特的疏水性，可以通过比较衍生化前后DP7 信号来证明氟化标记对聚糖离子化效率有影响。图1是由等量的DP7 和氟化DP7 混合的MALDI-MS分析图。对于天然聚糖(DP7 Na) 相对强度是2.8，而检测到衍生化的(DP7 HFUA H) 、(DP7 HFUA Na) 和(DP7 HFUA K) 相对强度分别为13.5、96、3和11.4。总的氟化DP7 信号强度比天然DP7 提高超过40倍。另外，用右旋糖苷1000来进一步评价氟化标记的性能，它是一种由葡萄糖单位经不同程度聚合形成的支化多糖。与没有衍生化的样品对比(支持信息 图S2a)，聚合度从4到15样品经氟标记后，信号强度和信噪比(S/N)均有所提高，很容易被检测到(支持信息 图S2b)。因此，氟标记能够极大程度提高聚糖疏水性和电离效率。

由于唾液酸基团不稳定，在之前的研究中已经发现在正离子模式下MALDI-MS分析将造成唾液酸的损失。为了解决这个问题，用我们的方法衍生化了一种标准的唾液酸聚糖A1(重均分子量为1932.7)。衍生化反应后，氟化衍生物A1重均分子量理论上应为2392.8。在氟化衍生化反应后，基于在m/z=2102.6 [A1 HFUA-SA H] 和在m/z=2124.6 [A1 HFUA-SA Na] 处观察到的信号峰，唾液酸在阳离子模式MALDI-MS分析中的损失有时仍然不可避免(支持信息 图S3)。然而这个问题可以通过在负离子模式下进行分析解决，此时在m/z=2391.7 [A1 HFUA-H]^-观察到信号峰(支持信息 图S3d)。与DP7 类似，A1的信号相对强度在氟衍生化后得到极大提高，这意味着我们的方法对于唾液酸基团是有效的。

在聚糖质谱分析中，泛甲基化是最常用的衍生化方法之一。与未加工的聚糖相比，泛甲基化聚糖有着更高的离子化效率。用DP7 聚糖模型比较了氟衍生化聚糖和泛甲基化聚糖离子化效率。用Ciucanu和 Costello的方法对DP7 聚糖进行泛甲基化衍生化，泛甲基化的DP7 在m/z=1497.7([PerDP7 Na] )出现离子峰。我们将等量的泛甲基化DP7 和氟化DP7 (10pmol )混合进行MALDI-MS分析。如在支持信息 图S4中所示，泛甲基化聚糖[PerMeDP Na] 的信号相对强度为11.8，而检测到氟化DP7 [DP7 HFUA H] 、[DP7 HFUA Na] 和[DP7 HFUA K] 的信号相对强度分别为18.1、97.8和5.1。氟化DP7 总的信号强度比泛甲基化DP7 高十倍，表明氟化DP7 离子化效率比泛甲基化DP7 高得多。但泛甲基化方法本身存在一定限制。在泛甲基化反应前，聚糖需要从蛋白质和聚糖混合物中提纯；而以我们的方法，聚糖可在蛋白质存在下直接进行衍生化反应。泛甲基化方法需要消耗大量时间和劳动力，这必定导致样品损失。我们的方法在泛甲基化中，使用的不是液-液萃取而是氟的固相萃取来收

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