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一种新颖的基于用高效液相色谱-荧光检测和质谱定性分析进行荧光标记检测食品中微量醛的方法

摘要 一种稳定、高效、灵敏、高选择性的、可以同时检测食品中的11种醛的方法已经建立起来了，这种方法是通过使用一种新的荧光标记试剂2-（12-苯并[b]-吖啶-5-(12H)-基)-肼(BAAH)，进行高效液相色谱-荧光检测和质谱定性分析。BAAH与醛之间的衍生反应通过相应曲面法进行优化。在反相的Hypersil BDS C₈柱上，以乙腈水溶液作为流动相进行二元梯度洗脱，达到完全分离时仅需要18分钟，线性系数大于0.9994。这种方法有着良好的重现性和较低的检出限（0.21～0.58nM，信噪比为3），已经成功地应用于分析各种食品中的醛，并且表现出良好的适用性。

关键词 醛、HPLC-FLD-MS/MS、柱前衍生、响应曲面法、食品

引言 近来，与食品相关的健康危害问题正引起广泛的关注。在食品的制作过程中，特别是油炸、发酵过程中，很容易产生醛，并且在高温时，随着食品中糖类、蛋白质、脂肪的破坏，醛的含量不断增大。近些年，食品中醛的检测受到广泛关注，许多种醛在酒、熟食、水果、蜂蜜等食品中都被定性检查出来。绝大多数的醛被认为对生物组织有腐蚀、刺激、致癌的危害。甲醛是一种高毒性的挥发性致癌物，能够造成哮喘、流眼泪、皮炎、呼吸系统不适以及肺部浮肿；酒中的乙醛能与核苷酸反应生成混合缩醛，增大女性患乳腺癌的风险；糠醛（FA）由戊糖变性产生，对生物体有着毒性作用；己醛和丙醛是亚麻油中主要的有毒复合物。除此之外，醛会直接影响到食品的质量。例如，醛被认为对酒水、饮料的口味有着很重要的影响。因此，在与健康有关的研究中，建立一种高灵敏度、高选择性的测定食品中痕量醛的分析方法尤为重要。

然而，在复杂的基质中直接检测醛是很困难的，因为醛没有发色团或荧光团，并且醛的挥发性和活泼性较强。为了克服这些问题，先是要考虑分析前醛的化学衍生。各种各样检测醛的衍生方法已经被报道出，一般的分析方法是基于固体吸附剂吸附富集后进行热脱附的气相色谱法（GC）。一些GC方法描述了测定水或废气中醛的2,4-二硝基苯肼(DNPH)衍生产物。实际上，醛衍生产物的GC分离效果并不好，因为衍生产物的挥发性偏低，并且在高温的GC工作条件下，衍生产物会发生分解。与GC相比，用HPLC进行分析时，可以直接将醛转变为许多的不同的醛衍生物，衍生生成低极性的衍生产物，这样可以解决一些问题，例如，峰拖尾、检测灵敏度低等，这时使用LC更容易进行分析。因此，柱前衍生高效液相色谱法已经广泛用于精确检测复杂基质中的醛。荧光检测是多种目标物质测定的最佳选择，近来，在这方面的热潮已经促进许多荧光试剂的产生，例如，芴-9-基-甲酯基肼、O-(2,3,4,5,6-五氟苄基）羟胺、2,4-二硝基苯肼、O-苯二胺以及1,3,5,7-四甲基-8-丁酰肼-二氟化硼-二吡咯甲烷。许多荧光试剂有着肼基作为反应位点。尽管许多试剂有着足够的灵敏度去检测空气、水、呼出气冷凝液、酒中的醛，但是在应用中仍存在着一些问题，例如，检测波长短、相关灵敏度低、稳定性差，以及在检测实际样品时会有很严重的干扰。因此，建立一种新的有着高灵敏度、高选择性、试剂与衍生产物有着很好的稳定性的醛检测方法尤为重要。目前，我们实验组已经合成出一系列基于苯并吖啶酮（BA）的衍生试剂。众所周知，BA具有荧光特征、稳定性优异、受溶剂和pH影响较小、荧光量子产率高、摩尔吸收系数大。其中的一种试剂2-（12-苯并[b]-吖啶-5-(12H)-基)-肼(BAAH)，有着很高的灵敏度和选择性，已经被应用于脂肪酸的检测。在本研究中，采用高效液相色谱荧光检测方法（FLD）在Hypersil BDS-C₈柱上利用BAAH对醛进行检测，在一些食品中检测出了含有包括糠醛以及甲醛到癸醛的11种醛。就目前所知，BAAH荧光检测是第一种醛检测的方法。

分析组分的充分衍生标记是非常重要的。传统的分析化学优化衍生方法是改变一个独立变量同时保持其他因素不变，这种方法很麻烦，不仅耗时耗材，还忽略了参量间的相互作用。为了解决这些问题，本研究采用多变量统计技术进行相应曲面设计。RSM中的Box-Behnken设计因子水平只需要三水平，实验次数较少。与其他方法相比，Box-Behnken设计更简易、更高效地安排和分析实验。因此，在本研究中，采用BBD设计优化主要的醛衍生参数。

材料和方法

仪器

实验使用电喷雾离子阱LC/MS(1100 Series LC/MSD Trap, a complete LC/MS/MS)。所有的HPLC系统设备都是HP1100系列，设备由一个真空脱气装置(model G1322A)、一个四元泵(model G1311A)、一个自动进样器(model G1329A)、一个恒温柱箱(model G1316A)和一台荧光检测仪构成(model G1321A)。衍生产物在Hypersil BDS-C₈柱(200 mmtimes;4.6 mm, 5 mu;M,Dalian Yilite Co., China)上进行分离，HPLC系统由化学工作站软件进行控制。质谱来自Bruker Daltonik (Bremen, Germany)，配备有大气压化学电离源。荧光激发、发射光谱由650-10S荧光分光光度计(Hitachi)测得。流动相经由0.22micro;m尼龙膜过滤(Alltech,Deerfield, IL)。

药品

标准的醛试剂包括糠醛、甲醛、乙醛、丙醛、正丁醛、戊醛、己醛、庚醛、辛醛、壬醛和癸醛均从Sigma Co(St. Louis, MO)购买。纯乙腈（HPLC级）从Yucheng Chemical Reagent Co(Shandong Province, China)购买。三氯乙酸（分析纯）来自Shanghai Chemical Reagent Co。水由Milli-Q 超纯水系统(Millipore,Bedford, MA)制得。用于衍生反应的0.1%标准三氯乙酸(TCA, catalyst)由用无水乙腈溶解三氯乙酸晶体制得。BAAH由我们实验室合成。除特别说明外，所有的试剂都是分析纯级别。

标准液的准备

标记试剂溶液(1.0times;10^minus;3 mol/L)由31.7mgBAAH溶解在10mL无水乙腈中制得。醛溶液(1.0times;10^minus;2 mol/L)保存在乙腈中，用于HPLC分析的标准醛溶液(1.0times;10^minus;4 mol/L)通过用乙腈稀释每种醛相应的储备液(1.0times;10^minus;2 mol/L)制得。所有的标准试剂在不用时，都保存在4°C的冰箱中。

样品预处理

酒（红酒、白酒、米酒）、酸奶、土豆片、油条、炸虾、咸鱼、蜂蜜等所有的食品，均从本地的超市或零售商购买。每一个酒样品在衍生前，都要经过0.22micro;m尼龙膜过滤。分别向5mL乙腈中加入2g土豆片、油条、炸虾、咸鱼提取出其中的醛，20分钟超声波浴后，取上清液进行接下来的分析。酸奶样品用离心机离心分离20分钟，转速4500rpm，温度4°C，上清液通过与乙腈1：4进行混合进一步脱去蛋白质（200micro;L的上清液加入800micro;L的乙腈中），之后，生成物再离心分离15分钟，转速、温度不变，收集上清液直接进行衍生。蜂蜜溶液由2g均匀样品溶于超纯水定量至10mL制得。所有的衍生样品在进柱前，都要经过0.45micro;m过滤膜过滤。

衍生方法

BAAH-醛衍生反应在乙腈溶液中进行，三氯乙酸为催化剂。20micro;L的混合醛乙腈溶液(1.0times;10^minus;4 mol/L)（或是120micro;L样品提取溶液）加入到2.0mL的小瓶中，随后加入20micro;L的1.0%TCA乙腈溶液和100micro;LBAAH乙腈溶液(1.0times;10^minus;3 mol/L)。然后将小瓶密封，将混合物加热52°C，恒温10水浴12分钟，用冰水冷却来停止反应。取10micro;L的衍生物溶液注入HPLC。BAAH与醛的衍生方案如Fig.1所示。

HPLC分离条件

BAAH衍生物的HPLC分离是在Hypersil BDS-C₈柱进行二元梯度洗脱。流动相A是5%的乙腈水溶液，B相是纯乙腈。进样前，柱内的流动相组成是60%A和40%B。流动相梯度方案如下：0～10分钟，B：40～55%；10～25分钟，B：55～100%。流速为1.0mL/min，柱温30°C。荧光激发、发射波长分别设为280、510。

醛衍生物离子碎片由大气压化学电离源质谱以正离子模式定性分析。乙腈中的混合醛按照优化好的衍生方案进行衍生。取10micro;L衍生产物溶液注入LC-APCI-MS系统中。APCI探针加热到400°C，以确保流出物完全汽化。其他的质谱条件如下：喷雾器压力60psi，干燥的气体温度350°C，干燥的气体流速5.0L/min，APCI Vap温度450°C，电晕电流（毫微安培）4000（pos），毛细管电压3500V。为了获得稳定、灵敏的MS离子电流响应，喷雾室和电晕针针尖（APCI）需要每天用30%的丙醇水溶液清洗。

柱前衍生优化的Box-Behnken设计

实验使用Design Expert软件进行实验设计、数据分析和模型建立。模型的统计分析用来评估方差分析（ANOVA），多项式模型方程拟合的质量由测定的R²系数表示，回归分析的意义由F测试和p值检测出。三变量的Box-Behnken设计用于确定响应模式和建立模型。三个因素包括反应温度（X₁）、BAAH与醛的摩尔比（X₂）和反应时间（X₃），基于单因素设计选择这三个因素进行更进一步的优化。Table 1 列出了BBD矩阵和响应值，用于建立模型。

选择戊醛作为测试的化合物，峰面积为响应值。为了预测最佳点，经验上是使用一个二阶多项式模型去联系不同独立变量与响应值之间的关系。对于三因素，可以用下面的方程来表示其中的关系：

Y = beta;₀ X₁ beta;₂X₂ beta;₃X₃ beta;₁₁X₁² beta;₂₂X₂² beta;₃₃X₃² beta;₁₂X₁X₂ beta;₁₃X₁X₃ beta;₂₃X₂X₃

Y为响应变量，beta;₀不变，beta;₁为线性系数，beta;₂为二次系数，beta;₃为相互作用系数。

结果与讨论

RSM优化柱前衍生参数

应用多元回归分析法对实验数据进行分析，响应变量和测试变量的关系可由二阶多项式方程表示：

Y=3652minus;261.1X₁ 98.98X₂ 136.9X₃minus;336X₁X₂minus;361.9X₁X₃minus;110.7X₂X₃minus;589.0X₁²minus;240.1X₂²minus;56.95X₃²

实验结果的方差分析表明，所有的线性参数和二次参数显著水平plt;0.01，缺适性实验的F值微不足道，这意味着这个模型能够精确地预测相关的响应值；变量系数(C.V.%)为8.30%，表明这个模型重现性较好。

说明非独立变量与独立变量间关系的3D响应曲面如 Fig.2 所示，

Fig.2a表明反应温度与BAAH量（BAAH摩尔量/醛摩尔量）之间在峰面积上的相互影响。如Fig.2a所示，衍生温度确定时，峰面积随着BAAH量的增加而增大，到达最大值后再增加BAAH量，峰面积不再变化。从Fig.2b 可以看出，反应温度和反应时间有着明显的相互影响。反应时间确定时，峰面积随着温度的升高先增大后减小，最佳温度52°C。类似的，Fig.2c 描述了BAAH量和反应时间在峰面积上的影响。

通过使用Design Expert软件分析可知，测试变量的最优值为：反应温度51.77°C，BAAH与醛的摩尔比为4.34，反应时间11.24分钟。在优化的条件下，戊醛的峰面积预测值最大为37500。考虑到操作的方便

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