富含黄酮类成分的紫荆花链叶可防止伊立替康化疗对IEC-6细胞和小鼠的肠道毒性作用

摘要

本研究评估了紫荆叶中富含类黄酮的部分（FRF-BF）对伊立替康诱导的肠毒性的影响。这种植物的叶子像巴西民间药物中的茶一样使用，并且富含黄酮类化合物，主要是山奈素。首先，在暴露于伊立替康的肠道细胞（IEC-6细胞）中评估FRF-BF和kaempferitrin的化学预防作用。接下来，针对小鼠中伊立替康诱导的粘膜炎评估效果。最后，在C57BL / 6小鼠中诱导黑素瘤以评估FRF-BF对伊立替康抗肿瘤活性的干扰。结果显示FRF-BF和kaempferitrin在IEC-6细胞中不发挥细胞毒作用，并证实用FRF-BF和山奈素预处理对伊立替康诱导的细胞毒性具有化学保护作用。有趣的是，FRF-BF（100 mg / kg，po）降低了小鼠的肠道蠕动，并减弱了与伊立替康诱导的肠粘膜炎相关的参数，包括腹泻，组织学损伤，双重GSH的消耗，TNF-alpha;的量，和MPO在小肠中的活动。此外，FRF-BF不干扰伊立替康的抗肿瘤活性并且在鼠黑素瘤中发挥抗肿瘤活性。总之，FRF-BF（100 mg / kg，p.o）具有良好的药理学潜力，可预防和减轻化疗期间肠粘膜炎的严重程度，这与头孢菌素的存在有关。

关键词

十二指肠，肠粘膜炎，kaempferitrin，黑色素瘤

1. 介绍

如有必要，癌症治疗包括化疗，放射治疗，手术或联合治疗等策略（Saletti，Sanna，Gabutti，＆Ghielmini，2018）。可悲的是，这些治疗的副作用很强烈，并且在大多数患者中发生（Song，Baik，Hong，＆Sung，2016）。在化疗副作用中，消化道粘膜炎是临床肿瘤学实践中的关键问题。

消化道粘膜炎的特征是胃肠道粘膜溃疡性病变而这又与几种症状相关，如腹痛，厌食，腹泻，呕吐和恶心（Bastos等，2016; Reinke等， 2015; Santos-Filho等，2016）。在这种模式中，这种情况会对接受化疗或放疗治疗的患者的生活质量产生负面影响。此外，这种毒副作用发生在超过40％的癌症患者中，导致肿瘤学中断治疗，损害总体生存（Reinke等，2015; Wardill，Bowen，＆Gibson，2014）

消化道粘膜炎的特征是胃肠道粘膜溃疡性病变而这又与几种症状相关，如腹痛，厌食，腹泻，呕吐和恶心（Bastos等，2016; Reinke等， 2015; Santos-Filho等，2016）。在这种模式中，这种情况会对接受化疗或放疗治疗的患者的生活质量产生负面影响。此外，这种毒副作用发生在超过40％的癌症患者中，导致肿瘤学中断治疗，损害总体生存（Reinke等，2015; Wardill，Bowen，＆Gibson，2014）。

伊立替康是一种拓扑异构酶I抑制剂，专门用于治疗结肠癌（美国国家医学图书馆，n.d。）。尽管伊立替康作为抗肿瘤药物具有有效性，但已证实伊立替康对非肿瘤性肠粘膜（主要是十二指肠）的有害作用，并且研究结果强有力地表明这种化学疗法导致肠上皮细胞紧密连接缺陷，导致粘膜屏障功能障碍和肠粘膜炎的发生（Wardill等，2014）。

虽然已经研究了肠粘膜炎超过30年，但是仍然没有临床上成功的药物治疗干预来预防或治疗这种疾病（Santos-Filho等，2016）。最近研究了一些具有抗炎和抗氧化特性的草药产品作为肠粘膜炎的有希望的治疗方法，例如acteoside（Reinke等，2015），Curcuma longa L.（Santos-Filho等，2016），Bidens pilosa L.（Bastos等，2016），麦麸阿拉伯木聚糖补充剂（SONG等，2016），Colotropis procera（de Alencar等，2017），水飞蓟素（Elyasi，Hosseini，Niazi Moghadam，Aledavood，＆Karimi， 2016），和草药制剂补中益气（Gou，Gu，Xiong，＆Wang，2016）。在协议中，使用传统的植物药物治疗化疗引起的恶心和呕吐（Chen，May，Zhou，Zhang，＆Xue，2016），将天然产物作为替代疗法的潜在来源，以尽量减少化疗方面效果。

紫荆属由约300种物种组成，分布在热带国家，是生物活性次级代谢物（主要是黄酮类）的有前途的来源。紫荆花（Bauhinia forficata Link），俗称“牛爪”（paw-of-cow），广泛用于巴西民间医学（Cechinel-Filho，2009）。在B.forficata制剂中发现了不同的次级代谢产物，包括类黄酮，酚酸和单宁。然而，类黄酮，如山奈素，山奈酚和槲皮素是在B.forficata制剂中以主要浓度存在的化合物，为该植物提供强抗氧化性质（Miceli等，2016）。事实上，B.forficata已显示出多种药理作用，如抗氧化剂，抗糖尿病药（Farag，Sakna，El-Fiky，Shabana，＆Wessjohann，2015），抗突变（Duuml;sman等，2013），肝脏保护剂（Salgueiro等，2016）。 ）和利尿剂（De Souza等，2017）。

考虑到肠道毒性是可能影响癌症治疗的化学疗法的严重副作用，并且黄酮类化合物已知并被证明是有效的抗氧化剂和抗炎化合物，富含B.offataata黄酮类化合物的部分可能可预防和缓解肠粘膜炎。 。因此，本研究调查了来自B.forficata（FRF-BF）的富含黄酮类化合物的部分对伊立替康在肠上皮细胞（IEC-6细胞）和小鼠中的肠毒性的影响

2.材料与方法

2.1试剂和化学品

伊立替康（CPT-11，来自Pfizer，Itapevi，巴西），洛哌丁胺（来自Janssen，SaoJoseacute;dosCampos，巴西）; 3,3#39;，3,5#39;-四甲基联苯胺，3-（4,5-二甲基噻唑-2-基）-2,5-二苯基四唑溴化物-MTT，Folin-Ciocalteau，谷胱甘肽-GDH，十六烷基三甲基溴化铵（来自Sigma，St.Louis，USA），二甲基亚砜-DMSO，过氧化氢，N，N-二甲基甲酰胺（均来自Synth，Diadema，Brazil）; Dulbecco的改良Eagle培养基 -DMEM（来自Vitrocell，Campinas，巴西）;胎牛血清-FRS（来自Gibco，Waltham，USA）。氯化铝，乙醇，甲醇，乙酸乙酯，氯仿，酚红（均来自Vetec，里约热内卢，巴西）;羧甲基纤维素（Infinity Pharma，Rio de Janeiro，Brazil）和McConkey Agar and Blood Agar（来自Kasvi，Satilde;oJoseacute;dosPinhais，巴西）。

1. forficata叶子于2015年4月在Santa Catarina（巴西）的Itajaiacute;收集。简言之，将新鲜叶子（115.5g）切成小块并在25℃下用甲醇（900ml）浸渍7天。使用旋转蒸发器在减压下除去溶剂后，获得甲醇提取物（5.5g，4.76％收率）。将提取物悬浮在甲醇：水（50:50）混合物中并进行液 - 液分配，得到氯形式级分（1.5g，21.8％产率）和乙酸乙酯加丁醇级分（3.75g，68.2％）。让）。根据De Souza等人描述，2017;乙酸乙酯和丁醇馏分具有相似的色谱图，因此，它们被组合并称为FRF-BF。色谱法通过与真实样品的直接比较，用于鉴定作为FRF-BF中主要类黄酮的山奈素。

2.2细胞培养

2.2.1 |细胞活力

首先，验证了FRF-BF，kaempferitrin和伊立替康对小肠ephitelial细胞（IEC-6细胞）细胞活力的影响。 IEC-6细胞购自里约热内卢细胞库（BCRJ），并接种于Dulbecco#39;s Modified Eagle#39;s Medium（DMEM），补充10％胎牛血清（FBS）和10-mu;g/ ml人体胰岛素（在5％CO 2气氛，37℃下）24小时。然后铺板细胞在96孔板（1times;105）中与载体一起孵育（磷酸盐 缓冲盐水），30％二甲基亚砜，FRF-BF（1-30mu;g/ ml），在24小时内，用山fer素（1-30mu;g/ ml）或伊立替康（10-100mu;M）。此后，将3-（4,5-二甲基噻唑-2-基）-2,5-二苯基四唑溴化物（MTT，0.5mg / ml）加入细胞中并在37℃下温育3小时。在用二甲基亚砜溶解还原的甲crystals晶体后，在570nm处分析吸光度。以比例：Abs计算细胞活力的百分比。样品-ABS。白色/ ABS。车辆times;100。

2.2.2|伊立替康诱导IEC-6细胞的细胞毒性

在24小时期间，将IEC-6细胞（1times;105 /孔）与伊立替康（30或100mu;M）加FRF-BF（10,30或100mu;g/ ml）同时孵育。在此期间后，进行MTT测定以验证细胞活力，如第2.2.1节所述。

为了验证FRF-BF或kaempferitrin对伊立替康诱导的细胞毒性的化学预防作用，将IEC-6细胞接种，接种（1times;105），并与不同浓度的FRF-BF或kaempferitrin一起孵育（10,30和100mu;g/ ml）。 24小时后，将细胞暴露于伊立替康（30或100mu;M）。 24小时后，进行MTT测定以验证细胞活力，如2.2.1节所述。

2.3 |小鼠肠运动的测量

将禁食的雄性瑞士小鼠随机分开并用载体（水，10ml / kg，n = 6），洛哌丁胺（10mg / kg，n = 6）或FRF-BF（30,100和300mg /）口服治疗。在给予0.8ml半固体标记物溶液（0.05％苯酚红加1.5％羧甲基纤维素）之前30分钟，每组给予kg，n = 6。 20分钟后，对小鼠实施安乐死，并将小肠切除，从小脑到回盲部连接处测量肠动力，如Reynell和Spray（1958）所述，稍作修改。然后测量小肠的总长度和酚红溶液覆盖的距离。肠道转运以百分比表示。

2.4|伊立替康诱导的肠粘膜炎

将小鼠随机分成不同组（n = 6）并用载体（水，10ml / kg），洛哌丁胺（10mg / kg）口服治疗，

或14天内FRF-BF（100 mg / kg）。第一次口服给药后7天，动物每天一次接受伊立替康（75mg / kg，i.p），持续5天。用载体治疗的另一组小鼠，称为幼稚组，在同一时期内接受盐水（10ml / kg，i.p）代替伊立替康。从第12天到第13天，动物继续接受口服治疗，

在治疗期间每天称重小鼠，无菌取出器官（脾，肝，十二指肠和结肠）并在安乐死后称重。立即将脾脏和肝脏样品分离至细菌移位测定。此外，收集一部分（约2cm，大约）结肠和十二指肠，称重并在37℃下干燥2小时，以将湿重和干重作为水肿指示进行比较。将其他区段（约2cm，大约）的结肠和十二指肠固定在由80％甲醛加15％乙醇和5％乙酸组成的溶液中以进行组织学程序。将剩余的结肠和十二指肠片段在-80℃冷冻直至生化分析。

2.4.1|肠细胞亚组分的制备

将十二指肠和结肠样品用200mM磷酸钾缓冲液（pH6.5）匀浆，并用于测量还原的谷胱甘肽（GSH）和肿瘤坏死因子-alpha;（TNF-alpha;）。之后，将匀浆在4℃以4,000rpm离心20分钟，并在沉淀物中测量髓过氧化物酶（MPO）活性。

2.4.1量化GSH水平

将等份的50mu;g组织匀浆与12％三氯乙酸混合，离心（4,000rpm，在4℃下15分钟），如Sedlak和Lin dsay（1968）所述。在420nm处测量上清液加TRIS缓冲液（0.4M，pH8.9）和0.01M 5,5#39;-二硫代双硫代2-硝基苯甲酸的吸光度。将值内插至GSH（1-10mg / ml）的标准曲线，并表示为mg GSH / g组织。

2.4.3| TNF-alpha;的测定

使用来自BD Biosciences（Franklin Lakes，NJ）的ELISA试剂盒，根据制造商的说明分析来自十二指肠和结肠的TNF-alpha;量。在450和550nm下测量吸光度，结果表示为pg / ml。

2.4.4| MPO活动

如Bradley等人所述进行MPO活性。 （1982）并由Young，Kheifets，Ballaron和Young（1989）修改。简而言之，将如上所述制备的沉淀物悬浮在0.5％十六烷基三甲基溴化铵中，并在4℃以12,000rpm离心20分钟。在50mM H 2 O 2和18.4mM 3,3#39;，3,5#39;-四甲基联苯胺存在下，在620nm测定上清液中的MPO活性，并以mili-optic density（mOD）/ mg蛋白质/ 3分钟。

2.4.5|评估细菌移位

无菌收集来自暴露于伊立替康的小鼠的脾脏和肝脏样品，并将片段（~100mg）置于具有无菌磷酸盐缓冲盐水的24孔板中。对于微生物学检查，将片段均质化并接种在McConkey琼脂和血琼脂培养物中。然后，将样品在37℃下培养并在24小时，48小时和7天后检查（Alencar等，2002）。

2.5|小鼠黑色素瘤诱导

如Arifa等所述，在诱导的黑素瘤中，在动物的右侧皮下注射2times;105个B16F10黑色素瘤细胞。 （2016）。将动物分成以下组（n = 6）：载体，载体加伊立替康，FRF-BF加伊立替康和FRF-BF。肿瘤诱导后15天开始治疗，每天给药一次，持续6天。口服给予载体（水，10ml / kg）或FRF-BF（100mg / kg），而通过腹膜内途径给予伊立替康（75mg / kg）。使用数字卡尺每天测量肿瘤面积（mm 2）一次。在治疗期结束后，将小鼠在CO 2大气中安乐死;切除肿瘤并称重。然后，使用数字卡尺测量每个肿瘤的体积（mm 3）。

2.6|统计分析

对于参数数据，已经使用t检验或单因素或双向方差

英语原文共 17 页

资料编号：[3954]