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深色有隔内生真菌LBF-2对药用植物枸杞的影响
深色内生菌（DSE）是广泛存在的根内共生真菌; 然而，我们对其生态功能的认识甚少。在这里，我们探究了DSE真菌对宿主植物枸杞的积极影响。将从枸杞根部分离的DSE真菌菌种LBF-2接种到植物的根上，接种植物的在温室条件下生长五周。ITS鉴定的结果表明，LBF-2与Paraphomachrys anthemicola的相似性为96％。使用光学显微镜在枸杞的根皮质细胞中观察到黑化的隔膜菌丝。接种LBF-2使总生物量增加了39.2％，并且还增强了叶绿素含量。与未接种对照相比，接种使总叶绿素浓度增加22.8％，叶绿素a浓度增加21.3％。这些数据表明，LBF-2分离物可用于促进具有药物应用的枸杞的生长。
关键词：叶绿素含量，黑色有隔内生真菌，枸杞，药用植物
1. 前言
在自然生态系统中，草本植物的根几乎能够被丛枝菌根（AM）和深色有隔内生真菌（DSE）定殖（Jumpponen and Trappe，1998; Mandyam and Jumpponen，2005）。DSE是子囊菌，广泛存在于各生态系统中，如高山、极地、沙漠和温带生境等（Jumpponen和Trappe，1998）。DSE实际上是一类真菌，其包括许多不同的物种，例如通常只有松散相关的Phialocephala fortinii，Heteroconium Chaetospira，Leptodontidium orchidicola（Schmidt等人，2008；Porras-Alfaro等人，2008；Newsham等人2009；Wu等，2010；Yuan等，2010）。与关于AM真菌的大量文献相比，关于DSE共生的研究是有限的。DSE真菌对植物的影响知之甚少，目前在科学界有很多争论（Jumpponen和Trappe，1998；Mandyam和Jumpponen，2005；Gruuml;nig等，2008；Newsham，2011）。
以往研究表明DSE真菌的接种效果呈现促进、抑制以及无明显差异等结果（Jumpponen，2001; Mandyam和Jumpponen，2005; Wu和Guo，2008; Alberton等，2010）。虽然发现DSE真菌对松树、桦树和铁秀兰的生存和生物量有负面影响（Wilcox和Wang，1987；Stoyke和Currah，1993），但DSE对以下植物的生物量和高度有积极影响，如苔草（Haselwandter和Read，1982），椿树（Newsham，1999），杜鹃（Vohniacute;k等，2005）和雪莲（吴和郭，2008）以及珙桐的芦丁含量（吴等，2010）和番茄的果实产量和品质（Andrade-inares等，2011）。为了进一步明确植物对DSE接种的响应机制，对18项独立研究进行了综合分析。该分析表明，相对于未接种的对照， DSE接种增加地上部分、根以及总的生物量，并且使植物的氮和磷含量显著增加26-103％（Newsham，2011）。李等的结果也表明，DSE分离株H93可以促进暴露于重金属条件下的玉米（Zea mays L.）的生长。
枸杞（茄科）是在东北亚，欧洲东南部和地中海盆地常用的落叶多年生草本植物，它具有显著的生物活性，如抑制癌细胞增殖和增强免疫反应（卢和王， 2003；张等，2005；尹和党，2008）。因此，本研究的目的是探究DSE菌株LBF-2和宁夏枸杞之间的相互作用。旨在（1）检测LBF-2在枸杞幼苗组织中的分布；（2）探究LBF-2产物对枸杞幼苗生长，叶绿素浓度和叶绿素含量的影响。从而为DSE真菌在药用枸杞栽培中的实际应用提供依据。
2. 材料和方法
2.1 植物和真菌材料
宁杞1号是枸杞栽培品种，具有较强的抗旱耐盐性，因此广泛分布于中国西北干旱半干旱地区，主要分布在宁夏回族自治区等（郑等，2010）。按照Silvani等人的方法（2008）稍作修改，我们采集枸杞根系，并在48h内完成对DSE的分离。将在马铃薯葡萄糖琼脂（PDA）培养基上的分离的菌株在25°C条件下暗培养，并将典型菌株保藏在西北农林科技大学林学院微生物实验室。初步研究证实，LBF-2分离物对枸杞发育有积极影响，因此选择它作为下列研究。
2.2 LBF-2的形态和分子鉴定
通过形态学和分子测序技术的组合鉴定LBF-2菌株。我们将该菌株置于MMN琼脂培养基上（Marx，1969），并在25℃暗培养2周，然后在光学显微镜（Olympus BX51，日本）和扫描电子显微镜（JSM-6360LV，JSM，日本）下观察菌丝的形态。对于LBF-2的分子鉴定，我们使用CTAB方法（Doyle和Doyle，1987）从1.0g LBF-2的新鲜菌丝体中提取DNA，并使用ITS-1扩增ITS1 / ITS-4引物组（White等，1990）。然后使用DP 209试剂盒（中国天根）纯化PCR产物并立即使用具有pGM-T载体（天根）的DH5alpha;克隆试剂盒将其克隆。重新确认的克隆通过Sangon Biotech Co.，Ltd（China）的DNA序列分析仪（DNA Sequence Analyzer）（3730 XL，ABI，USA）进行测序。使用基本的局部比对搜索工具将获得的序列与国家生物技术信息中心（NCBI）的数据库中的可用序列进行比较。我们将序列保存在NCBI核苷酸序列数据库中（HTTP：//www.ncbi.nlm.nih.gov/LAST; 登录号：HM242215）。我们使用Lasergene软件包（版本4，DNA Star Inc.，USA）的Megalign程序对rDNA ITS区序列进行比对，并且使用邻接法在LBF-2和其他ITS数据的ITS序列的基础上构建了系统发生树PAUP * 4.0 b10。以1000次重复进行Bootstrapping（Thompson等，1994）。
2.3 接种LBF-2
为了更全面地探索DSE分离株LBF-2对宁夏枸杞的性能的影响，我们用分离株LBF-2接种宿主植物的幼苗。我们于2009年10月从宁夏农林科学院收集了宁夏枸杞一号种子，并用10％（v / v）H2O2消毒10 min，然后用去离子水在室温下温和洗涤，并将它们放在无菌的潮湿过滤器上纸张催芽。将生长良好的幼苗转移到盆中。
使用吴和郭（2008）描述的方法，并做进一步修改。我们将包含从MMN培养基平板获得的菌丝体的直径4.5 mm的菌饼添加到选定的幼苗的根际上。对照由添加到幼苗根际的未接种的MMN培养基组成。实验由随机设计组成，对照和接种物处理重复两次。每个盆中含有生长在高压灭菌的苗圃基质中的五个幼苗（n = 30，对照和接种处理）：蛭石（10:1，v / v），pH6.5和有机碳，具有可用的氮和磷浓度分别为108g / kg，191mg / kg和190mg / kg。幼苗在温室条件下生长，在28℃下每天光照12小时，通过每两周用50ml无菌霍格兰营养液灌溉每个盆，将基质水分恒定保持在60-70％（w / w）（Hoagland和Arnon，1950）。
2.4 DSE定殖
将根样品清除并通过Barrow和Aaltonen（2001）描述的方法染色并修改用于显微镜观察。每种处理随机选择6株植物，并检查来自根系不同部分的样品。将每个样品35个根碎片装载在载玻片上，并在具有数字传感器（Olympus）的显微镜下观察。使用Image-Pro Express 6.0分析软件（奥林巴斯）观察黑色的隔膜菌丝的图片。
2.5 植物对LBF-2接种的生长反应
为了探究LBF-2对枸杞生长性能的影响，我们在接种后35天仔细地从它们的底物上除去幼苗。随机选取每种处理6株植物进行研究。用自来水洗涤根，然后用蒸馏水洗涤。然后测量叶子和根尖的数量，根长度和枝条长度。随后将每种处理中六个盆的幼苗在70℃下干燥48小时以测量干重（AUW220，Shimadzu，日本）。
2.6 叶绿素荧光和叶绿素浓度
为了确定枸杞光合系统对LBF-2接种的响应，我们使用便携式叶绿素荧光仪（Mini PAM，德国）测量了叶绿素荧光。我们使用标准仪器设置（饱和脉冲12000 mmol-2sec-10.8秒）和波长为735 nm的额外远红光，以便估计基态荧光（Walz，1993）。我们测量了每种处理6株植物的四个完全展开的叶片上的叶绿素荧光，这些叶片在黑暗中放置30分钟后仍附着在植物上（Sheng et al。，2008）。我们测量了非光化学荧光猝灭（NPQ），基础荧光（F0#39;），非光化学猝灭（qN），光化学猝灭（qP）和Y（II），因为这些参数对AMF和DSE的存在高度敏感（sheng等，2008; 吴等，2010）。对于叶绿素浓度我们在5ml丙酮与乙醇的1：1混合物中加入叶组织（0.2gFW），并将提取物在4℃下在黑暗中温育直至叶片失去其色素沉着。我们使用Porra（2002）给出的方程，用分光光度计（UVmini-1240，日本）在663和645nm波长处测量叶绿素a和b浓度作为吸光度的函数。
2.7 统计分析
使用Student#39;s t-检验比较接种和未接种的幼苗之间的生物量，叶片和根尖数量，高度和叶绿素浓度，叶绿素荧光参数。用JMP9.0（SAS Institute Inc.，USA）进行统计分析。
3. 结果
3.1 LBF-2的形态和分子鉴定
LBF-2在MMN培养基上培养一周的形态如图1所示。LBF-2在培养基上的菌落呈黑色（图1A），扫描电子显微镜显示LBF-2具有直径约4mu;m的小梭状菌丝（图1B）。光学显微镜显示LBF-2具有黑化的隔膜菌丝（图2A）。LBF-2不产生分生孢子。对rDNA的ITS区域进行测序表明LBF-2属于子囊菌门，并且该分离菌株与寄生小孢霉FJ426984，FJ426985（图3）的GenBank序列具有96％的相似性。
图1.（A）两周时在MMN培养基上LBF-2的形态，培养皿直径为90毫米。（B）在扫描电子显微镜下观察菌丝的形态。（A）和（B）中的标尺分别为30mm和10mu;m。
图2.（A）在光学显微镜下观察的LBF-2菌丝的形态（B）在宁杞1号幼苗的根中定殖的LBF-2的光学显微照片。 MSH和M分别代表黑化的隔膜菌丝和微菌核。（A）和（B）中的标尺分别为20mu;m和50mu;m。
图3.基于邻近连接方法评估的基于LBF-2和其他DSE分离株的ITS序列的系统发育树。节点上的数字表示引导值。比例尺表示遗传距离。
3.2 LBF-2在枸杞组织中的定殖和分布
LBF-2在接种的枸杞幼苗的根皮质细胞中产生黑化的隔膜菌丝（MSH）和微菌核（M），并且根长度定植百分比为81.2％（图2B）。未接种的对照幼苗未被感染。
3.3 DSE分离物对生长性能的影响
我们发现接种LBF-2对L. barbarum幼苗表现有益。接种的枸杞苗比未接种苗重39.2％（P lt;0.05;图4A）。接种LBF-2对根长没有影响（Pgt; 0.05），但株高增加了43.7％（P lt;0.001;图4B）。接种LBF-2也使根尖数量增加了1.2倍（P lt;0.001），叶片数量增加了21.5％（P lt;0.05;图4C）。
3.4 DSE分离物对光合作用的影响
LBF-2接种对枸杞宁杞1号幼苗光合作用有明显的促进作用。与未接种对照相比，我们记录了接种植物中叶绿素a（P lt;0.001）和叶绿素a b（P lt;0.05）浓度分别增加21.3％和22.8％（图5A）。对叶绿素b没有影响（Pgt; 0.05）或叶绿素a / b比率（数据未显示）。接种幼苗叶绿素荧光动力学参数F0，qN和NPQ与对照相比均无显着差异（均Pgt; 0.05），但Y（II）和qP均显着高于接种幼苗在未接种的对照中（均P lt;0.001;图5B）。
(A)
(B)
(C)
图4接种LBF-2对枸杞宁杞1号幼苗生物量，（B）根长和枝高，（C）叶片和根尖数量的影响。值是平均值（n = 6），竖线是标准误差（SE）。与对照值显着不同的接种植物的值用 P lt;0.05表示
Plt;0.001.
(A)
(B)
图5 LBF-2接种对枸杞宁杞1号幼苗叶片叶绿素含量和（B）叶绿素荧光动力学参数的影响 FW代表鲜重。值是平均值（n = 6），竖线是标准误差（SE）。与对照值有显着差异的接种植物的值用 P lt;0.05和P lt;0.001表示，ns表示无显着差异。
4. 讨论
大多数药用植物具有深色有隔内生真菌（DSE）和丛枝菌根真菌（Muthu-kumar等，2006; Zubek和Błaszkowski，2009; Zhang等，2010），这两种菌对植物都有显著的影响增长表现（Smith和Read，2008; Newsham，2011）。虽然已知AM真菌对药用植物的光合能力和次生代谢物产生具有有益效果（Abu-Zeyad等，1999; Copetta等，2006），但是关于这些植物如何对DSE真菌作出反应的认识目前是有限的。在本研究中
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