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苯胺降解好氧颗粒污泥的快速形成及其微生物群落演替规律研究
姜宇1，魏利2，杨开1，施雪卿3，王弘宇1
（武汉大学土木工程学院，武汉 430072；2. 哈尔滨工业大学城市水资源与环境国家重点实验室，哈尔滨 150090；3. 新加坡国立大学土木与环境工程系水工研究中心，新加坡 117576）
摘 要：苯胺是石油和化工等行业常见的副产品之一，其排放近年来引起越来越多的关注，好氧颗粒污泥（AGS）技术被认为是处理苯胺最有希望的生物过程之一。但是，也存在一些缺点，例如启动时间长，尤其是当系统用于有毒污染物（例如芳族化合物）时。在这项研究中，研究了苯胺生物降解的AGS的快速形成，15天内好氧颗粒在含有苯胺废水供给的序批式空气反应器（SBAR）中成功形成。AGS形成后，污泥体积指数从58.47降至30.31 mL/g。还发现在好氧造粒过程中，胞外聚合物（EPS）尤其是蛋白质含量显著增加。此外，从第3天到第15天（混合液中微小颗粒早期观测以来），苯胺和COD的平均去除率分别为99.93％和90.59％，SBAR中NH4 -N也显著降低。通过焦磷酸测序分析，变形杆菌是造粒过程中最丰富的门，有几个属导致苯胺生物降解和EPS分泌，例如假单胞菌被发现在系统中占主导地位。在本系统中，AGS的快速形成和苯胺与COD的高去除率可能为处理含有苯胺的工业废水提供了一种可供选择的方案。
关键词：苯胺，生物降解，好氧颗粒污泥，快速造粒，微生物群落
1 引言
工业活动的迅速增加导致了含有大量挥发性有机污染物的废水大量排放。在这些污染物中，苯胺是一种结构简单的普通有机胺。苯胺是制药、农药、染料、爆炸物、香料、橡胶和塑料等各种行业中广泛使用的原料之一。苯胺及其衍生物也是石油、造纸、煤炭和化学工业的副产品。人们一致认为，苯胺可能对水生生物甚至人类造成很大的危害。苯胺对中枢神经系统、肝脏和肾脏具有很强的毒性，当进入人体血液时，它可以将血红蛋白转化成甲基血红蛋白，阻碍氧气摄取。因此，没有适当处理的苯胺工业废水可能对人类健康和生态系统的平衡构成重大威胁。同时由于其具有生物难降解性和高水溶性等特点，苯胺被列为持久性有机污染物。同时也受到美国环境保护局、欧洲经济委员会等许多世界上其他组织越来越多的关注。基于环境保护举措和绿色行业不断增长的市场需求，开发可持续的苯胺去除技术至关重要。传统上，应用物理化学方法（即氧化、吸附和光解等）去除苯胺。然而，由于序批式反应器（SBR）、生物膜反应器等生物苯胺降解技术具有环保和低成本的特点而具有优势。基于有效降解苯胺的菌体如根瘤菌和假单胞菌的报道，近年来含苯胺工业废水的生物处理引起了广泛的关注。
好氧颗粒污泥（AGS）是一种轮廓清晰、内部结构紧凑的密集微生物聚集体，它是通过功能性微生物聚生体在没有任何载体的情况下自我固定形成的。近年来，AGS技术被认为是最有希望的生物学过程之一，已广泛应用于各种废水如啤酒废水、垃圾渗滤液、低浓度废水和含盐废水中有机物的降解和营养物质的去除。与传统的絮状活性污泥相比，AGS有几个突出的特点。例如，AGS具有较高的沉降速度，这有利于污泥分离和生物量的保留；另外，AGS表面的好氧区和中心的厌氧区实现了同步脱氮除磷；同时，由于沿紧凑结构产生的扩散梯度，好氧颗粒能够承受有毒污染物。因此，在AGS生物反应器中已经成功地实现了苯酚、硝基酚、甲酚和许多其他难处理有机污染物的生物降解。
AGS的形成是一个复杂的过程，并且受到HRT、N/COD比值和剪切力等因素的影响。在以前的许多研究中，尤其是在不利条件下，开发稳定的好氧颗粒需要相当长的时间。例如，在含高铵废水的SBR中形成硝化颗粒污泥需要55天，在155天的操作中铵的去除率为99％。同样，Leong等人在酸性和碱性条件下利用发酵城市废水进行好氧制粒，作者发现在好氧颗粒SBR启动166天后得到了稳定的好氧颗粒，在此期间，絮状生物量逐渐聚集。关于有毒芳香族化合物的降解研究，成熟好氧4-氯苯胺降解颗粒在SBR中的形成持续了75天。同时，泉等人接种半成熟好氧颗粒作为种子污泥开展了降解2,4-二氯苯氧乙酸的AGS的研究,接种167天后颗粒最终稳定。因此，为了提高AGS处理含苯胺工业废水的应用潜力，开发快速造粒工艺具有十分重要的意义，因为它可以大大缩短粒状反应器的启动时间。迄今为止，关于生物降解苯胺的AGS生物反应器的快速启动和利用焦磷酸测序进行微生物群落演替的研究还没有。
为了填补这一研究空白，本研究的目的是为了实现用于含苯胺废水处理的序批式空气反应器（SBAR）的快速造粒。 研究了AGS形成过程中污泥的性质，并通过测定在一个周期内的去除效率，评估其对苯胺、COD和营养物质的去除性能。 而且，微生物群落在有机污染物的生物降解中起着关键的作用。因此，采用高通量焦磷酸测序技术对SBAR造粒过程中的微生物群落和长期运行过程进行了分析。这项研究旨在提供对生物过程，特别是AGS系统降解苯胺的生物过程的新见解。
2 材料和方法
2.1 种子污泥和反应器
接种到生物反应器的活性污泥来自中国武汉的龙王嘴市政污水处理厂的生物池，絮凝污泥呈褐色，结构疏松，经过几天的预处理之后作为种子污泥。AGS培养在由有机玻璃制成的圆柱形SBAR中（高1米times;直径0.08米）， 反应器的有效容积为4L，带有一个多孔石材扩散器是空气和进水的入口安装在SBAR的底部，使用反应器半高处的电磁阀排出废水以确保50％的体积交换率，通过使用电子温度控制器将反应器的温度保持在25plusmn;5℃的中温条件下。
2.2 SBAR的启动
在AGS为期15天的快速造粒期间，SBAR以4小时为一个周期操作一次，最初的周期包括填料5分钟、曝气220分钟、沉降10分钟和滗析5分钟（图S1），操作周期由可编程数字定时器自动控制。在SBAR启动之前，系统开始投加絮状活性污泥，以确保混合液生物量浓度为3500plusmn;300 mg/L，初始沉降时间设定为10分钟以适应种子污泥较慢的沉降速度，逐渐减少到5分钟，以调整污泥沉降性能并得到显著改善。好氧颗粒完全形成后，沉降时间保持5分钟，通过使用转子流量计调节空气流量使曝气阶段的溶解氧（DO）浓度控制在7.0plusmn;0.5mg/L。表1列出了进水的组成，微量元素是细胞中酶促反应必需的辅助因子，本研究中使用的配方是培养活性污泥微生物群体进行好氧制粒的常用方法。AGS用于处理缺乏微量元素的废水时，微量元素溶液的成分如表2所示，用于进水溶液的化学试剂为分析纯。在运行过程中，每个周期结束时通过电磁阀从SBAR中采集水样，以检测污染物的残留浓度，每隔2天取一次污泥，观察污泥形态并确定污泥性质。
表1 进水的组成
|
组分 |
浓度（mg/L） |
|
苯胺 |
200 |
|
KH2PO4 |
21.9 |
|
K2HPO4·3H2O |
36.8 |
|
CaCl2 |
138.75 |
|
微量元素溶液 |
1 mL/L |
表2 微量元素溶液的组成
|
组分 |
浓度（g/L） |
|
FeCl3·6H2O |
5.0 |
|
H3BO3 |
0.10 |
|
CuSO4·5H2O |
0.10 |
|
KI |
0.20 |
|
MnCl2·4H2O |
0.50 |
|
Na2MoO4·2H2O |
0.20 |
|
ZnSO4·7H2O |
0.30 |
|
CoCl2·6H2O |
0.15 |
|
EDTA-2Na |
10.0 |
2.3 微生物群落分析
采集4个污泥样品用来研究造粒过程中SBAR微生物群落的演替情况和稳定期，分别在第1、7、15和90天从反应器中收集S0、S1、S2和S3。使用PureLinkreg;基因组DNA试剂盒从污泥样品中提取总基因组DNA，通过Nanodrop 1000分光光度计（Thermo Fisher Scientific，Waltham，MA，USA）监测DNA的完整性、纯度和浓度。通过使用通用引物338F：5#39;-ACTCCTACGGGAGGCAGCA-3#39;和806R：5#39;-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3#39;扩增部分16S rRNA基因，反应混合物的组分（20mu;L）显示在表S1中。聚合酶链式反应（PCR）按照上海大众生物制药技术有限公司（中国上海）提供的方法进行：94℃变性5分钟，然后按照94℃30秒、53℃30秒和72℃45秒的顺序循环30次，第30次循环结束后，在72℃下进行最后10分钟的修复和延伸。将四个样品的PCR产物送至Illumina MiSeq平台（PE300，CA，USA）进行测序，Usearch（版本7.1）开展了业务分类单元（OTU）聚类分析，对于使用DNA测序技术的微生物群落分析，OTU是分类微生物群体的常用工具，超过97％相似性的DNA序列被认为是在相同的OTU下。使用具有97％相似性的OTUs软件Mothur ver.1.30.1确定稀疏曲线和多样性指数（Ace和Chao）。稀疏曲线是根据个体数量和种类数量构建的，它不仅可以用来比较具有不同数量序列的样品之间的物种丰富度，还可以用来说明样品序列数据是否合理。Ace和Chao指数用于估算一个群落的OTU数量，这可以反映每个污泥样品中微生物聚生体的群落丰富程度。
2.4 分析方法
为了评估去除污染物的性能，定期从系统中取出混合液，并用0.45mu;m的过滤器过滤以进行后续的测试。苯胺、COD和NH4 -N的残留浓度按照标准方法进行测定（APHA，2005），所有的测试做三份。在曝气阶段收集污泥样品，根据我们以前的研究，通过测定混合液悬浮固体浓度（MLSS）监测反应器中生物质的浓度，通过30min污泥体积指数（SVI）确定沉降性，通过YSI 550A多功能仪监测反应器的DO和温度，SBAR中的pH通过pH计（PHS-3C）测量，利用扫描电子显微镜（SEM; JSM-5610LV，JEOL Ltd.，Tokyo，Japan）以Tay等描述的预处理程序观察好氧颗粒的形态，包括固定、洗涤、脱水、干燥和最后一步喷金涂层。采用甲醛和氢氧化钠法提取污泥样品的胞外聚合物（EPS），根据Lowry法和苯酚-硫酸法分别检测EPS的蛋白质（PN）和多糖（PS），通过激光粒度分析系统（Malvern Mastersizer，2000，Malvern Instruments Ltd.，Malvin，U.K.）测定活性污泥以及AGS的粒度，它的原理是粒子对光的衍射。表S2总结了这项测试中使用的仪器。
3 结果和讨论
3.1 AGS的形成
接种种子污泥后，SBAR在高速曝气状态下运行。根据生物形态的变化确定造粒过程，AGS形成过程中系统中的污泥大小分布如图1a所示，该图显示了微生物在从絮状物转变为颗粒物的过程中的三种状态。运行的第一天，新鲜污泥是深棕色、不规则、蓬松、结构松散的，大部分生物质是絮状的，粒径分布在71.30mu;m左右，直径小于100mu;m的污泥比例为69.35％，大小在100~300mu;m之间的总生物量为27.02％，直径在300mu;m以上的污泥絮凝体所占的比例很小，只有2.81％的污泥颗粒直径在300~1000mu;m之间。培养3天后，系统中出现大量的微小絮状物，表明SBAR中的微生物能自发聚集。第7天污泥颜色变为黄褐色，直径在100-300mu;m的小颗粒污泥在反应器中所占比例很高，占生物质总量的98.86％。从第8天到第15天，反应器中的颗粒继续形成，污泥颗粒变得更致密，表面更光滑，形状更规整。在第15天，大部分的AGS（36.41
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