英语原文共 11 页
纯培养条件下深色有隔内生真菌（DSE）对重金属的响应
1.绪论：
土壤重金属已经成为全球最严重环境问题之一。土壤中金属含量的增加会通过食物链或受污染的饮用水危害人类和动物的健康，因此，这个问题有吸引了公众的广泛关注。内生真菌不仅有能力抵御重金属毒性，而且增加了寄主植物的营养获取能力，并通过增强其代谢活性以对抗逆境胁迫。在重金属污染土壤中发现了各种主要分类群中的真菌，其中一些真菌对重金属产生了抗性。因此，对保护内生真菌免受重金属毒害的机制的研究有待进一步深入。
深色有隔内生真菌（DSE）是一类内生真菌，广泛存在于各种应激环境中。它们是分生孢子或无菌子囊菌真菌，在活的植物根系中定居，不会造成任何明显的负面影响。DSE可以在约320属114科近600种植物中定殖。重金属污染土地上的许多优势抗性种类植物与DSE真菌有着广泛的联系。因此，这些真菌可能在保护植物免受重金属胁迫方面发挥重要作用。Likar和Regvar发现，沙柳DSE的定殖与土壤铅、镉有很大相关性，并认为DSE能提高柳树对重金属的耐重金属污染能力。Deram等人报道了土壤中镉浓度增加时DSE的定殖作用与AM定殖作用的消失相比是恒定的，这表明土壤重金属对AM有毒性，但对DSE没有毒性。DSE真菌可以很容易地从重金属污染的地方分离出来。张超等人从我国西南某冶炼厂废渣中分离到三株DSE菌株，发现不同DSE菌株对金属污染物的耐受性不同。研究表明，在50-350mg的范围内，随着向培养基中添加Cd2 ，外种皮中的黑色素含量增加。
DSE菌丝中的黑色素被认为是降低重金属毒性的细胞壁中最重要的成分。几项研究表明真菌黑色素具有结合重金属离子的能力。然而，对真菌黑色素在DSE重金属耐受中的作用仍缺乏认识。真菌黑色素的改变将直接影响菌丝形态，菌丝形态和菌丝特征与重金属的存在密切相关性。谷胱甘肽（GSH）是另一种重要的重金属耐受剂。它是真菌中最丰富的细胞富硫醇重金属结合肽，最近的研究倾向于将可溶性三肽作为抵御重金属细胞毒性的第一道防线。尽管抗氧化酶（如超氧化物歧化酶（SOD）和过氧化氢酶（CAT））的活性在重金属应激反应中变化很大，但对它们在重金属耐受性中的作用知之甚少。抗氧化酶的诱导，特别是SOD的诱导，是降低重金属胁迫下氧化损伤的重要保护机制，在细胞对活性氧（ROS）的防御机制中起着关键作用。
本研究的目的是：（1）对重金属污染土壤中植物根系中分离出的DSE真菌进行鉴定；（2）测定不同铅浓度胁迫下DSE真菌菌丝形态的变化；（3）研究了DSE真菌中的抗氧化物质黑色素、谷胱甘肽、超氧化物歧化酶（SOD）、过氧化氢酶（CAT）对Cd2 胁迫的反应。
2.材料和方法：
2.1 DSE种的分离与形态鉴定：
5个DSE菌株均是从在中国陕西省凤县海拔1189 m的铅锌尾矿上自然生长的沙打旺根中分离得到。土壤中铅、锌和铜的总浓度分别为1350.7、2105.4和526.4 mg/kg。根据McGonigle等人的方法，我们测定的DSE在植物根系的定植率为68%。采样于2010年9月进行。从五个随机选择的在矿山尾矿上自然生长的沙打旺个体中采集根样本。根据Ahlich和Sieber的方法分离出DSE真菌，并进行了适当更改。植物的根在自来水中洗涤，无菌条件下切割成2.0-2.5cm长的根段，表面用99%乙醇消毒1分钟，35%过氧化氢消毒5分钟，99%乙醇消毒30秒，用去离子水洗涤3次。从每个根片的中部在无菌条件下切下2-3 mm长的片段，放置于马铃薯葡萄糖琼脂（PDA）上，并在黑暗中25℃培养。从根部分离出深色真菌，转移到新鲜的PDA琼脂平板上。培养2周后，在光学显微镜（Olympus，BX51）下观察菌丝和孢子的形态。
2.2 DNA提取、PCR扩增和测序：
DNA是用CTAB法从5种DSE的2周纯培养物中提取出来的。底物ITS1 (59- TCCGTAGGTGAACCTGCGC-39) 和 ITS4 (59- TCCTCCGCTTATTGATATGC-39)用于扩增DSE真菌rDNA内转录间隔区（ITS）。在S1000PCR仪（Bio-Rad，美国）中进行PCR反应。在50微升反应体积中进行聚合酶链反应，该反应体积包含2 微升基因组DNA、2 微升每种引物（10 mm）、5 微升 106聚合酶缓冲液、7 微升25 mm mg2 、2 微升 2.5 mm dntp、1 微升 taq聚合酶和29 微升 ddH2O。条件包括在94℃下初始变性3分钟，随后在94℃下35个循环1分钟，55℃为45 s，72℃为2分钟，最后在72℃延长8分钟。PCR产物在1%琼脂糖凝胶中分离，用溴化乙锭染色，在UV光下可见条带。使用E.Z.N.A.H凝胶提取试剂盒切除和纯化目标条带。纯化的PCR产物连接到PGEM-T易载体中，大肠杆菌DH5alpha;活性细胞根据制造商推荐的方案用连接产物转化。使用通用引物SP6和T7对已确认的克隆进行测序（中国南京Genscript公司）。使用基本局部比对搜索工具（BLAST）对所有DNA序列进行编辑并与国家生物技术信息中心（NCBI）的可用序列进行比较，并以登记号JN123358–JN123361和JF508361提交给GenBank。
2.3 序列比对与系统发育分析：
对于系统发生树的构建，利用ClustalW进行序列比对，并利用Kimura双参数距离测量的邻接方法对MEGA 5.0进行发育分析。根据1000次重复的引导分析估计置信值。
2.4 与原宿主的回接实验：
为了验证这5个分离株是DSE真菌，采用Wu和Guo的方法对A.adsurgens进行了再合成实验，并进行了改进。用70%乙醇表面消毒50s，0.1%氯化汞7 min，去离子水冲洗3次。然后将沙打旺种子无菌地种植在培养瓶中的Murashige和Skoog（MS）固体培养基上。将生长良好的幼苗无菌转移到含有高压灭菌40毫升蛭石（10:1）和12毫升MS液体培养基的培养瓶中。在PDA上，从一个活跃生长菌落的边缘切下两个5mm的菌饼，加入DSE真菌接种物。无真菌对照组用无菌PDA菌饼进行模拟接种。所有培养物均在生长室中进行，光周期为每天12小时，25℃。
2.5 DSE侵染率测定：
经过6周的培养，采集了沙打旺的根系。随机抽取同一处理的根，对根系不同部位的根样进行检测。用Koske和Gemma方法清除和染色根样。将根切成1cm片，90℃下2.5%氢氧化钾处理60分钟，用5 N HCl酸化，用0.05%台盼蓝在乳酸甘油中染色。将染色根放置在玻片上，用数码相机（Qimaging，Micropublisher 5.0 RTV）在光学显微镜（Olympus，BX51）下观察。用Image Pro Express 6.0分析软件（Olympus）管理显示黑色素隔膜菌丝和显微镜的图片。
2.6 抗重金属DSE真菌的筛选：
用最低抑菌浓度（MIC）和抑制50%菌丝生长的有效浓度（EC50）评价了菌株对重金属离子的敏感性。选择改良的Melin Norkrans（MMN）培养基作为基础培养基，以获得最大的金属利用率，避免金属沉淀。从活跃生长的2周的DSE菌落边缘切下直径5mm的菌饼，并将菌饼置于经重金属离子修饰的固态MMN培养基上。铅（II）和锌（II）的浓度为0-4.5 mg/ml，铜（II）的浓度为0-2.0 mg/ml。菌落在黑暗中培养2周后收获，用微波加热1分钟使琼脂融化，小心取出菌丝，60℃蒸馏水冲洗3次，80℃干燥至恒重，称重。液体培养基比琼脂培养有几个优点。然而，由于DSE真菌是根内生真菌，需要注意的是，真菌菌丝体在没有固体基质的情况下的分化可能会影响对金属的敏感性。
2.7 通过扫描电子显微镜观察铅胁迫下菌丝形态：
观察到两种不同类型的菌丝。一种在不同浓度的铅固体MMN培养基上培养两周，另一种在液态MMN培养基中培养一周。然而，两种不同菌丝样品的处理方法是相似的。分离菌丝体，用2.5%戊二醛溶液在4℃下处理。用磷酸盐缓冲液（50 mm；pH6.8）冲洗2 h后，使用一系列浓度逐渐增加的乙醇溶液（30、50、70、85、90、95、100%）对样品进行脱水。最后完成了样品的干燥、安装和喷金工艺。然后利用JSM-6360LV扫描电镜（日本杰尔）对样品进行观察和拍照。
2.8 黑色素的提取纯化：
根据Ellis和Griffiths描述的方法，使用均质器在KOH（1 M）中高速均质10分钟。然后在超自然处理器（Sonics，VCX-130）中对均质物进行超声处理。黑色素在氮气中回流，用热碱（100℃下1 M KOH，5 h）从菌丝中提取。过滤后，用HCl（3 M）酸化滤液，直到
在pH2.0下沉淀。通过离心（10000，15分钟）收集所得的黑色沉淀物，并用蒸馏水洗涤。粗黑色素在100UC下用HCl（7 M）酸水解2 h，经离心（10000g，20 min）收集不可水解残留物，再用HCl（0.01 M）和蒸馏水依次洗涤。黑色沉淀物在干燥器中干燥，并在氮气中保存到需要时再用。
2.9 可溶性蛋白、谷胱甘肽含量测定：
蛋白质含量用牛血清白蛋白（BSA）蛋白检测试剂盒（南京建成，中国）测定，以BSA为标准。在NADPH和5，59-二硫代双-2-硝基苯甲酸（DTNB）存在下酶法测定GSH。将菌丝体接种于不同浓度重金属的MMN液体培养基中2周后收获。将收获的菌丝用蒸馏水冲洗三次，并在滤纸之间轻轻擦干。在液氮中粉碎后，将菌丝体（50 mg）在1.5 ml 0.1 N HCl中均质化。GSH分析混合物含有1.0ml上清液、2.5ml100mmol/l磷酸盐缓冲液（pH7.7）和0.2ml0.6mmol/lDTNB。根据安德森的描述，用分光光度法在412 nm下连续90 s测定DTNB还原为硝基苯甲酸盐。根据校准曲线测定谷胱甘肽的量，用缺乏谷胱甘肽的空白样品测定背景速率。用市售试剂盒（中国南京建成）按说明书测定了在Cd2 胁迫下，SOD和CAT的酶活性。通过黄嘌呤/黄嘌呤氧化酶系统产生的O2抑制硝基蓝四氮唑（NBT）的还原来测定SOD活性。一个SOD活性单位被定义为抑制NBT降低50%的酶的量。采用AEBI法，通过过氧化氢分解测定CAT的活性。一个CAT活性单位被定义为每mg蛋白质在1秒内降解1mmolH2O2。SOD和CAT活性以u/mg protein表达。
2.10 统计分析：
实验设置了四个重复。使用SPSS 16.0版软件包（美国SPSS公司）对数据进行统计分析，并以平均值6标准误差（SE）表示。采用Duncan的事后配对比较来检验不同处理之间差异的显著性，结果在p＜0.05时被认为是显著的。使用Sigmaplot for Windows版本10.0软件包制作图形。
3.结果：
3.1 DSE种的形态和分子鉴定：
从沙打旺根中分离得到5株DSE菌株（B145、B100、BC42、BC5和B142），5株DSE真菌在PDA培养基上均产生暗菌落，形成圆形或椭圆形菌落。这些DSE真菌的菌丝是深色的，具间隔，大约3-8mm宽。B145菌落生长缓慢，中心呈灰色。菌丝几乎笔直，具隔膜，微褐色。B100菌落呈灰褐色，粉末状，菌丝具隔膜，颜色较深。BC42菌落具隔膜，多数为褐色菌丝，生长缓慢，黑色，并常随年龄而变为棕色。培养2周后，缓慢生长的BC5菌落直径仅为3cm左右；菌落呈深褐色、绒毛状，菌丝呈间隔状和浅棕色。B142菌落多呈橄榄褐色和粉末状，菌丝具隔膜和色素。培养条件下只有B142形成分生孢子，其余4种DSE真菌均无孢子形成。B142分生孢子光滑，棘状，产生于具分枝的顶生链中。将5个分离株的ITS1-5.8S rDNA ITS2区序列数据存入GenBank，登记号分别为JF508361（B145）、JN123358（B100）、JN123359（BC42）、JN123360（BC5）和JN123361（B142）。根据系统发育分析结果，B145、G.cylindrosporus（AY428772）和P.graminicola（U17218）聚集在一起，引导值为99%。B145与G.cylindrosporus（AY428772）的进化关系非常密切（序列同一性为99%）。BC42，P.Mustea（AB190404）和暗隔内生植物DS16B（AF168783）形成了一个中等支撑的集群（76%）。BC42序列与野马的ITS区（AB190404）匹配，序列同源性为98%。DSE对重金属PLOS ONE的反应形成了一个99%的集群。BC5和E.Salmonis（Gu586858）形成了一个单系氏族，99%的独立支持和100%的序列恒等式。B142和C.cladosporioides（HQ832794）形成了一个终端集群，89%的独立支持。综上所述，这5个分离株属于不同的分类群，分别为：圆柱孢菌（B145）、菊花科（B100）、木霉属（BC42）、沙门氏菌（BC5）和枝孢菌属（B142）。
3.2 DSE真菌在沙棘根中的定殖作用：
这5个分离株均在接种的沙打旺幼苗的根皮质细胞中产生了黑色的隔膜菌丝和微珠，典型的DSE结构。成熟显微镜菌丝呈间隔状，壁厚，在宿主细胞内紧密排列。暗菌丝沿着与根纵轴平行的皮层生长。
3.3 抗重金属DSE真菌的筛选：
数据显示了所研究DSE物种的三种金属离子的EC50和MIC。五种DSE真菌对Cd2 和锌（II）的耐受性高于对Cu2 的耐受性。与其他两种金属离子相比，Cd2 对圆柱孢杆菌、菊花和枝孢杆菌的毒性较小。其对Pb2 的MIC值大于3.0 mg/ml，其中圆柱孢杆菌的MIC值最高，为4.5 mg/ml，EC50值大于1.0 mg/ml，圆柱孢杆菌对Pb（II）的EC50值大于1.8
以上是毕业论文外文翻译，课题毕业论文、任务书、文献综述、开题报告、程序设计、图纸设计等资料可联系客服协助查找。
