英语原文共 7 页，剩余内容已隐藏，支付完成后下载完整资料
短期内群体猝灭和营养条件
对活性污泥絮体的影响
萨勒希齐里·穆斯林；斯特凡诺·阿马尔菲塔诺；阿加塔·加利波利；安德里亚·贾尼科；哈桑·阿米尼·拉德；卡米拉·玛丽亚·布拉古利亚；斯特凡诺·法齐
集锦
bull;在QQ作用下，上清液中微生物单细胞和聚集物的丰度增加。
bull;QQ有利于混合液中自由生活的纳米鞭毛虫和纤毛虫的生长。
bull;饥饿条件下（内源期）QQ对微生物团聚体的解絮凝有显著影响。
bull;QQ制剂有可能抑制活性污泥微生物群落中蛋白酶的分泌。
摘要
群体感应信号调节活性污泥过程中的各种功能，如微生物聚集体的形成。这种被称为群体猝灭（QQ）的信号系统的干扰为消除与生物废水处理有关的一些问题（如生物污染和剩余污泥的产生）提供了机会。然而，人们对QQ系统如何以及在多大程度上影响微生物聚集过程和随后的絮体形成知之甚少。特别是，在考虑反应器中营养状况的同时，在微生物聚集体的尺度上进行深入的结构表征仍然被忽视。在这里，我们结合先进的微生物鉴定技术（流式细胞术、CARD-FISH和共焦激光扫描显微镜）和常规理化评估，在短期时间尺度（即外源期4h后和外源/内源期19h后）评估QQ效应。结果表明，在海藻酸钠多孔微球中固定化酰化酶（QQ）的作用下，外源期上清液中单个细胞和悬浮微生物的丰度没有明显变化。相反，在外源/内源期结束时，单个原核细胞的显著增加、小型和大型的微生物聚集体有利于食草动物的生长，包括自由生活的纳米鞭毛虫和纤毛虫。絮体变得比控制反应器中的絮体更疏松、更薄，从而影响污泥的沉降行为。微生物群落在内源期间对可溶性蛋白的降解能力不足，证实QQ制剂有可能抑制活性污泥微生物群落中蛋白酶的分泌。
关键词：群体感应；微生物聚集体；胞外聚合物；原生动物；营养状况
1 介绍
活性污泥法（AS）是以微生物、无机粒子和胞外聚合物形成的絮体为基础，在世界范围内广泛应用于生活污水和工业废水的生物好氧处理。据报告，微生物组成和细菌细胞间信息传递可确定絮体性质，并直接影响AS系统的管理（Chong等人，2012年；Fatimah等人，2019年；Govoreanu等人，2003年）。
群体感应（QS）是一种依赖细胞密度的细胞间通信过程，它基于信号分子的产生和对基因的反应来调节基因表达（Bassler，1999；Pan和Ren，2009）。QS过程可导致胞外聚合物质（EPS）的分泌和微生物聚集（Diggle等人，2007；Hentzer等人，2003）。QS破坏（即群体猝灭QQ）可通过细菌释放特定酶（如酰化酶、乳糖）来发生，这些酶通过破坏AHLs的酰基链或内酯环使信号分子失活（Dong等人，2001；Zhang等人，2002）。一般来说，QS和QQ细菌分别占活性污泥微生物群落总数的70%和30%（Chong等人，2012年；Morgan Sagastume等人，2005年）。QQ功能机制是造成牙菌斑形成障碍的原因（Oh和Lee，2018）。因此，QS和QQ工艺的直接改性可以为改善活性污泥系统中微生物团聚体的物理、化学和生物特性提供特定的机会。
为了促进序批式反应器（SBR）中颗粒生物量结构的形成（Huang等人，2019b；Ren等人，2010；Tan等人，2014），或为了提高废水处理中有毒化合物的降解性能（Valle等人，2004年），与细菌通讯系统工程相关的研究工作主要集中在提高废水处理中的QS增强。QQ在膜生物反应器中的应用被记录在案（Huang等人，2019a；Oh和Lee，2018；Shi等人，2018）。最近，QQ试剂（海藻酸钠珠中包埋红球菌、BH4）的新应用被开发为增强剩余污泥减少机制（如微生物捕食）的积极因素（Salehiziri等人，2018b，2018a）。
尽管QQ在生物废水处理工业中的工程化应用显示了絮体结构的直接改变，但在微生物聚集体尺度上的深入结构表征仍然被忽视。关于代谢信息（即营养状况）与群体感应系统整合的当前报告（An等人，2014；Boyle等人，2015；Zhao 等人，2016），这一问题的重要性将更高。从污水处理工程的角度来看，营养条件可以通过一个操作参数-食品微生物比（F/M）来控制，这意味着活性污泥工艺操作对生物反应器内所有QS依赖功能的影响。
在废水工程中开发QQ应用的首要要求是对微生物聚集体、细胞间信号系统和多种微生物营养状况之间的相互关系提供新的见解。因此，本研究旨在探讨分别代表富营养和饥饿条件的外源呼吸和内源呼吸下，在短时间尺度上对活性污泥微生物团聚体的QQ效应。这项研究将（i）在短时间内评估微生物游离细胞和聚集体，以及（ii）运用传统的物理化学评估和先进的微生物聚集体表征技术（流式细胞术、催化报告沉积荧光原位杂交，以及共焦激光扫描显微镜）。
2 材料和方法
2.1 群体淬火系统
酰化酶I（Sigma-Aldrich，9012-37-7）被用来干扰QS过程。酶固定化方法如下：将10毫升酰化酶I溶液（10毫克/毫升磷酸钾缓冲液，pH=7）加入30毫升4%海藻酸钠溶液中，轻轻搅拌30分钟，逐滴倒入氯化钙溶液（30%w/v）。20分钟后，用蒸馏水将新形成的QQ珠（直径约5 mm）洗涤三次，并在4℃的黑暗中保存。
2.2 实验装置
活性污泥是从当地的废水处理厂（罗马北部，780000 P.E.）取样的。以总悬浮固体（TSS）浓度3700plusmn;150mg/L和合成废水（CODsim;500mg/L，乙酸盐为碳源）为原料，建立了平行间歇反应器（250ml）。处理和控制反应器（即带和不带QQ珠的重复反应器）在固定温度（20°C）、黑暗和恒定通风条件下运行（图1）。在停止曝气30分钟后，在4小时和19小时从混合液（50毫升）和上清液（50毫升）中采集所需样品。根据实际限制条件，考虑到基质消耗、细胞生成和微生物捕食的普通每小时速率，选择短期培养时间。微生物外生过程（消耗合成废水）预计在培养的最初几个小时（即4小时）内发生，而外生和内源过程预计在较长的培养时间（即19小时）内发生。
图1 实验装置、操作条件和分析参数。重复控制（C4和C19）和处理（QQ4和QQ19）反应器分别运行4h和19h
2.3 微生物特性
2.3.1 流式细胞术
使用配备488nm固体激光（远地点流系统，英国赫特福德郡）的流式细胞仪A50 micro评估微生物游离细胞和聚集物的丰度。上清液样品固定在甲醛溶液中（最终浓度为2%），保持在4°C，并在最长8小时内进行分析。用SYBR Green I染色（1:10000稀释；分子探针，试管法）进行体积绝对计数。在绿色通道上设置了阈值，并以低流速运行样本，以使事件数保持在每秒1000个事件以下。光散射信号（即前向和侧向散射）和绿色荧光（530/30nm）被记录在每个单一细胞事件的特征中。固定门的设计是为了区分游离细胞（即原核生物和纳米鞭毛虫）和聚集体，根据它们在侧散射图和绿色荧光图中的特征（Gasol和Moraacute;n，2015）。使用主要由单个细胞（即饮用水）组成的对照水样设置光电倍增管电压和门控策略，并通过荧光显微镜或流式细胞术进行（Amalfitano等人，2018）。在前向散射直方图上对微生物聚集体进行后选通，并将其分为亚微米和微米颗粒（以下称为小聚集体和大聚集体），分别显示低于或高于用作内标的1mu;m尺寸校准珠（绿色荧光参比试剂盒，分子探针）。通过远地点直方图软件（v89.0-远地点流量系统）进行数据可视化和提取。
2.3.2 荧光、共焦和光学显微镜
根据别处描述的方案，通过催化沉积荧光原位杂交（CARD-FISH）评估细菌细胞的丰度（Fazi等人，2007）。用甲醛（1%最终浓度，1h）固定的细胞悬浮液（1 ml）的子样品过滤到0.2mu;m孔径聚碳酸酯膜（47 mm直径）上，并在-20°C下冷冻直到分析。然后用rRNA靶向HRP标记的探针（Biomers，Ulm，德国）对大多数细菌（EUB338，EUB338-II，EUB338-III）进行切割和杂交。用荧光显微镜（徕卡，DM-LB-30）观察染色细胞。利用共焦激光扫描显微镜（CSLM-OlympusFV1000）对牙菌斑的三维结构进行了特异性观察。微生物细胞包埋在Vectashield抗褪色贴壁培养基上，用DAPI染色。用Ar激光的488nm线激发杂交细菌细胞（激发），并在500到530nm的绿色通道中观察（发射）（Cruz Viggi等人，2014；Lupini等人，2011）。用Lugol碘溶液固定样品后，用光学显微镜（最终放大60倍）进行真核生物计数（Eikelboom，2000）。
2.4 污泥特性
按标准方法（APHA，2005）测定了可溶性化学需氧量（SCOD，0.4mu;m滤纸）和总悬浮物（TSS）。胞外聚合物（EPS）含量评估基于两层EPS结构，松散结合EPS（L-EPS）和紧密结合EPS（Wingender等人，1999）。L-EPS和T-EPS层的蛋白质和碳水化合物分别缩写为（L-EPS-P）和（T-EPS-P）和（T-EPS-C）和（L-EPS-C）。提取过程包括两个步骤：（i）在60°C下加热30分钟以分离L-EPS；（ii）NaOH处理（1 M）4小时，然后在80°C下加热以获得T-EPS（Salehiziri等人，2018a）。可溶性蛋白质的测定基于使用牛血清白蛋白标准溶液的双辛酸蛋白质测定法（美国罗克福德皮尔斯），该标准溶液是从Lowry方法（Lowry等人，1951年）改进而来的。可溶性碳水化合物的测定基于改良的DuBois方法（Braguglia等人，2012年；DuBois等人，1956年）。测定可溶性微生物产物（SMP）、蛋白质（SMP-P）和碳水化合物（SMP-C）的样品通过0.4mu;m滤纸后从上清液中取出。根据Torfs等人提出的方法，对污泥样品的间歇沉降曲线进行了评价。（2016年）（Torfs等人，2016年）。
3 结果和讨论
3.1 群体猝灭对自由细胞和微生物聚集的影响
通过流式细胞术评估，对照组（C4）和QQ反应器（QQ4）在4h时的单个细胞和悬浮微生物聚集体的丰度没有显著变化；大聚集体和纳米鞭毛虫（NF）略有减少（图2）。这些减少可能指的是高等生物的放牧，因为大团聚体中的任何解絮凝都会改变小团聚体的丰度。在19小时，与对照组相比，QQ处理组的单个原核细胞、小聚集体和大聚集体以及NF净增加（分别为52%、77%、59%和217%）（图2）。这些结果表明，QQ暴露对上清液质量有很大影响，也在短期时间尺度上确认微生物聚集体形成中的QS效应（Queck等人，2006）。关于QQ对微生物聚集体的作用机制，应考虑到活性污泥群落中存在多种QS和QQ基因，不仅支持QS和QQ活性的同时发生，而且群落行为受QS和QQ生物的联合活性控制（Li等人。，2017年；Tan等人，2014年）。QS和QQ微生物的信号传递和猝灭动力学对于确定整体信号梯度和随后的活性污泥过程功能具有关键作用。根据目前的研究，信号系统可能对营养状况敏感（Boyle等人，2015年），这表明细菌将代谢信息整合到与微生物群落合作的决定中（Gupta和Schuster，2013年）。关于QS系统与代谢信息之间的相互联系，人们有不同的看法。据报道，饥饿条件控制枯草芽孢杆菌细胞中细胞信号分子的产生，从而促进QS系统（Lazazzera，2000）。Boyle及其同事展示了一种供应驱动的激活，这种激活以非数字方式将代谢谨慎与群体感应结合起来，并允许铜绿假单胞菌细胞仅在群体规模足够大（群体感应）且单个细胞有足够的营养资源（尤其是碳）时才进行合作投资（Boyle等人，2015）。
图2 用流式细胞仪A50微型（远地点流系统，英国赫特福德郡）研究不同反应器上清液中单个细胞（a）、小聚集体（b）、大聚集体（c）和纳米鞭毛虫（d）的特性
在本研究中，我们发现在QQ4反应器实际运行于固定相（食物与微生物之比约为0.2～0.4）的外生期，多物种微生物群落在保护絮体结构方面具有协同特性。在这种情况下，QQ珠对改变群体特征没有影响，可能是由于溶液和珠内部AHLs浓度梯度较低。另一方面，通过进入QQ19反应器的内源期（饥饿状态），微生物群落产生了更多的AHLs信号。QQ珠破坏了这些信号，因此在反应器中占主导地位的是一种不合作的特性，从而导致絮体的去絮凝。因此，在活性污泥法微生物生长的固定相条件下，加上QQ试剂的存在，营养状况可能是微生物群落选择合作或不合作特性保护微生物团聚体的决定性因素。
3.2 微生物聚集体与污泥沉降特性
对上清液原核生物群落（图3）的CARD-FISH分析结果显示，QQ19的上清液中微生物聚集的发生率高于C19反应器，这与流式细胞仪的结果一致。这可能受到QQ19反应器中微生物群落合作特性变化的影响，从而导致活性污泥絮体部分解絮凝。三维CLSM图像重建显示，与对照组相比，QQ19反应器沉淀污泥中的微生物聚集体的出现率始终较低（图4）。QQ19反应器中的絮体较对照反应器中的絮体疏松、稀薄，促进了溶解氧和基质在团聚体中的扩散，影响污泥沉降。
因此，与对照相比，QQ19反应器中污泥的沉降行为表现出不同的相对较慢的沉降速度（图5），尽管沉降30分钟后两种污泥的沉降速度相似。
图3 培养19h后，C19反应器（a）和QQ19反应器（b）上清液中的DAPI染色细胞（蓝色）和细菌细胞（绿色）。样品在沉降30分钟后采集。Bar=20mu;m。右侧报告了微集料的详细信息；面板中Bar=10mu;m。（为了解释本图图例中对颜色的引用，请参考本文的Web版本。）
图4 共聚焦激光扫描显微镜（CLSM）结合图像显示了C19反应器（a）和QQ19反应器（c）污泥中DAPI染色的总细胞（蓝色）的空间分布（X-Y和Y-Z平面）。每幅图像由135（a）和67（c）个聚集层厚度的光学截面组成，每0.49mu;m.Bar=50mu;m.在面板（b）和（d）中报告3D重建。（为了解释本图图例
剩余内容已隐藏，支付完成后下载完整资料
资料编号：[239726]，资料为PDF文档或Word文档，PDF文档可免费转换为Word
以上是毕业论文外文翻译，课题毕业论文、任务书、文献综述、开题报告、程序设计、图纸设计等资料可联系客服协助查找。
