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Chloroflexi 中的丝状菌Eikelboom 0675 and 0041型菌：分析其在处理水系统中的存在并设计探针用于鉴定
Lachlan B. M. Speirs1, Zoe A. Dyson1, Joseph Tucci1 and R. J. Seviour2,lowast;
1Pharmacy and Applied Science, La Trobe University, Bendigo, VIC 3552, Australia and 2Microbiology Department, La Trobe University, Bundoora, VIC 3083, Australia
摘要
尽管目前已知许多种引起污泥膨胀的丝状细菌的生物特性，并设计了荧光原位杂交（FISH）探针用于其原位鉴定，但仍存在一些明显的例外。本文报告了Eikelboom 0041和0675型的鉴定。由于这些形态类型仅在细丝直径方面不同，因此它们通常在基于显微鉴定的调查中一起考虑。本研究表明它们在系统发育上是不同的，因此不应该被视为单个群体的形态变体。含有0041和0675型的澳大利亚强化生物除磷（EBPR）污水厂生物质的扩增子测序数据和系统发育分析表明，与许多其他膨胀细丝形态类型一样，它们都是绿弯菌门的成员，可能是两个不同属的代表。本文描述了针对两种类型的FISH探针。对澳大利亚污水厂的调查表明，0675型更多地出现在除磷的污水厂中，而0041型没有显示出这种偏好，在来自各种类型污水厂的生物样品中均可见。
关键词：活性污泥；荧光原位杂交（FISH）;焦磷酸测序; Eikelboom 0675型; Eikelboom 0041型;绿弯菌门
引言
自25年前荧光标记的核糖体RNA靶向寡核苷酸探针对单个细菌细胞的原位鉴定和可视化的设想和应用（DeLong，Wickham and Pace 1989; Amann，Krumholz and Stahl 1990）以来，人们对复杂微生物群落的理解有了很大进展（Nielsen，Daims and Lemmer，2009; Seviour and Nielsen，2010; Wagner and Haider，2012）。荧光原位杂交（FISH）已被广泛应用于许多自然和工程生境，包括活性污泥，它在识别去除氮磷的关键群体（Daims, L uml;ucker and Wagner 2016; Stokholm-Bjerregaard et al. 2017）和揭示膨胀丝状细菌的真实生物水平(Nielsen, Daims and Lemmer 2009)中发挥了至关重要的作用。FISH也可用于提供定量数据（Nielsen，Daims and Lemmer 2009）。该技术以及对信号增强的修饰（例如CARD-FISH）通常与包括微放射自显影（MAR-FISH），外酶标记（例如BODIPY-FISH，ELF-FISH）和组织化学染色在内的技术相结合，以便更好地从个体细胞水平理解群体的生理学和生物化学（Nielsen, Daims and Lemmer 2009; Seviour and Nielsen 2010; Wagner and Haider 2012; Stokholm-Bjerregaard et al. 2017）。虽然FISH是一种优雅而强大的技术，但它并非没有限制。例如，在设计FISH探针之前需要知道合适的系统发育标记序列，通常是16S或23S rRNA基因的序列（Amann and Fuchs 2008; Noguera et al. 2014）。对于那些可以作为纯培养物回收的生物来说，这是一项简单的任务，但对于活性污泥中大部分不可培养的种群来说相对困难（e.g. Wagner et al. 1994b; Beer et al. 2002; Kohno, Sei and Mori 2002; Speirs et al. 2009, 2011; Nittami et al. 2009; Kragelund et al. 2011）。因此，Eikelboom（1975）的几种丝状膨胀细菌形态类型仍然未被鉴定，也没有针对它们的靶向FISH探针（Nielsen, Daims and Lemmer 2009; Seviour and Nielsen 2010）。
其中两种是Eikelboom 0041和0675型。两者都在世界各地的活性污泥系统中常见，并且通常在活性污泥丝状体调查中含量丰富（Jenkins, Richard and Daigger 2004; Tandoi, Jenkins and Wanner 2006; Seviour and Nielsen 2010）。0041型最初被描述为革兰氏不定型，不分枝，具有隔膜和鞘的丝状体，其细胞呈正方形或矩形，通常为附着生长，与Eikelboom 0675型的区别仅在于其细丝直径稍大（Eikelboom 2000; Jenkins，Richard and Daigger 2004）。在许多调查中，这两种类型被组合在一起（即0041/0675型），因为它们的细胞直径没有明显差异，无法从个体微观形态识别（Seviour et al. 1990） 。尚不清楚是两种不同的丝状细菌还是同一生物的不同生长形式，因为它们未经过无污染培养，也没有可用的16S或23S rRNA序列数据。FISH调查数据表明，两种形态类型都包含属于绿弯菌门（Bj uml;ornsson et al. 2002; Kragelund et al. 2007; Nittami et al. 2014），变形菌门（Thomsen，Kragelund and Nielsen 2006）和Candidatus#39;Saccharibacteria#39; （Hugenholtz et al. 2001; Kindaichi et al. 2016）的成员。
尽管0675/0041型丝状体在生物质样品中常见，但较低的相对含量和附生细菌的存在使得其难以用显微操作法鉴定。目前可以利用下一代测序（NGS）平台来获得16S rRNA基因高变区的高通量扩增子序列数据，以允许更大的微生物群落的分析深度，通常每次测序回收gt; 106个单独的16S rRNA序列。因此，这可以从相对含量较低的群体中检索序列，包括一些膨胀的丝状细菌。本文描述了如何使用罗氏454测序来识别Eikelboom 0041和0675型及设计FISH探针。
实验步骤
生物质收集和DNA提取
从澳大利亚首都直辖区（ACT）的活性污泥厂采集生物质样品，在冷藏条件下送往实验室。立即将等分试样固定在50％乙醇或4％（wt / vol）多聚甲醛（Daims，Stoeker and Wagner 2005）中， -20℃储存，用于FISH分析。将剩余样品4℃储存， 24小时内进行DNA提取。为减少偏差，使用了三种DNA提取方法：McIlroy等人（2008）描述的基于三氯乙酸钠的方法，Tillett和Nielen（2000）描述的基于黄原酸盐的方法和FAST DNA Spin Kit（Obiogene，Melbourne，Victoria）。
显微分析
根据Jenkins，Richard和Daigger（2004）给出的描述，使用亮场显微镜观察样品的革兰氏染色和Neisser染色，确定丝状细菌形态类型。按照（Speirs et al. 2009, 2011; Speirs, Tucci and Seviou 2015）所述，使用表面荧光显微镜和表1中列出的FISH探针进行暂定分类。使用E800荧光显微镜（Nikon）或FV10i共聚焦激光扫描显微镜（Olympus）采集图像，使用ImageJ（Rasband 1997）和Photoshop（Adobe）组合图像。丝状体丰度基于Jenkins、Richard和Daigger（2004）描述的主观方法。
FISH探针验证
根据Amann，Krumholz和Stahl（1990）的方案对生物质样品进行FISH，其中修改由Daims，Stoeker和Wagner（2005）详述。使用的甲酰胺浓度是每个探针在原始出版物中推荐的浓度，或在验证新设计的探针时凭经验确定（见结果）。探针购自Sigma（Melbourne, Australia）并用CY3，CY5或FLUOS荧光染料标记。EUBmix（Amann et al. 1990; Daims et al. 1999）和non-EUB（Wallner，Amann and Beisker 1993）探针的应用分别为FISH提供了阳性和阴性对照。由于许多绿弯菌门缺乏EUBmix目标位点（Speirs et al.2009,2015; Kragelund et al.2011），CFXmix（Gich, Garcia-Gil and Overmann 2001; Bj uml;ornsson et al. 2002）探针也被用作阳性对照。
表1.本研究中使用和设计的FISH探针序列。
Na =不合适; ND =未确定。
PCR方案
使用GeneAmp PCR System 9700热循环仪（Applied Biosystems）对提取的DNA进行PCR，将产生的16S rRNA扩增子组合。使用通用细菌引物U27f（5rsquo; -GAGTTTGATCMTGGCTCAG-3rsquo;）和U1492r（5rsquo; -GGYTACCTTGTTACGACTT-3rsquo;）扩增16S rRNA基因序列，循环条件如下： 95℃5分钟1个循环; 95℃30秒，42℃30秒，72℃80秒，25个循环; 72℃10分钟1个循环。每30 mu;L PCR反应液包含：3.0mu;L各缓冲溶液10x（Applied Biosystems），25mM MgCl2（Applied Biosystems），2mu;M dNTPrsquo;s（Roche），50％DMSO（Sigma），5mu;M正向引物和5mu;M反向引物（Geneworks）; 0.3mu;L AmpliTaq Gold（Applied Biosystems）; 10.7mu;L无菌milliQ级蒸馏水; 1mu;L模板DNA。在1.5％琼脂糖凝胶上合并PCR产物。用干净的剃刀切下约1450bp产物，并根据制造商的说明用SV凝胶净化系统（Promega，Melbourne，Australia）纯化。
扩增子测序和数据处理
将每种提取方法得到的纯化16S rRNA基因扩增子以相等的量合并至终浓度为20 ng mu;L-1，并将20mu;L转移至1.5mL塑料管中，送至实验室（Lubbock，Texas，USA）使用Roche 454 GS FLX（Roche，Switzerland）系统进行扩增子焦磷酸测序。将测序数据去噪（Reeder and Knight，2010），使用Quantitative Insights into Microbial Ecology（QIIME）软件包（v1.8.0）（Caporaso et al. 2010b）进行分析。通过Phred质量值（ge;25）和扩增子读长（ge;200bp）过滤测序数据。修剪正向和反向引物、接头和条形码序列，并将多重读数分配给各个样品。使用#39;Chimera Slayer#39;脚本（Haas et al. 2011）筛选并除去嵌合序列。进一步的数据处理涉及许多步骤。使用阈值0.97（默认设置为ge;97％相似度）和代表性序列将读数汇总到OTU中（Edgar 2010），然后使用PyNAST（Caporaso et al. 2010a）将GCU序列与Greengenes数据库（v12.10）（DeSantis et al. 2006）比对，并使用RDP分类器（Wang et al. 2007）和MiDAS数据库（McIlroy et al. 2015）进行分类。最后，使用QIIME生成OTU表、交互热图、丰度分布图和稀疏曲线。
OTUStalker软件开发
由于没有软件包可用于分离16S rRNA基因扩增子序列数据，我们设计了OTUStalker软件。OTUStalker用Java 1.7.0编写，具有易于操作的图形用户界面，并已成功通过Mac OSX 10.9.3，Windows Vista / 7和Ubuntu 14.04 LTS操作系统测试。OTUStalker旨在使用指定的分类群（本例中为Chloroflexi）过滤QIIME（v1.8.0）处理数据，然后从选择的OTU获得所有序列数据，包括原始读数和质量值数据。OTUStalker生成日志和数据文件作为组合输出，通过样本隔离数据，以便后续分析。OTUStalker（可从https://github.com/zadyson/OTUStalker获得）和详细的用户信息列在补充说明（支持信息）中。
FISH探针设计
使用ARB软件包（Ludwig et al.2004）#39;PROBE DESIGN#39;工具和来自SILVA release 111 rRNA序列数据库（Quast et al.2013）的序列数据完成FISH探针设计。使用Ribosomal Database project（RDP）（Cole et al. 2009），Probe Check（Loy et al. 2
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资料编号：[792]
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