英语原文共 10 页，剩余内容已隐藏，支付完成后下载完整资料
原位检测，分离和生理特性产甲烷细菌丰富的细丝状微生物粒状污泥：与克隆有关的新型分离物集群，绿色无硫细菌，细分I
YUJI SEKIGUCHI，1,2 *高桥幸雄，YOICHI KAMAGATA，2 AKIYOSHI OHASHI，1 ANDHIDEKI HARADA1
长冈县立大学环境系统工学系新泻县长冈940-2188,1和国家先进工业研究所生物资源研究所科学技术（AIST），茨城县筑波市305-8566,2日本2001年7月13日
收到/ 2001年9月26日接受
我们以前表明，非纤细丝状细菌隶属于部门绿色非硫细菌在充满蔗糖的嗜热产甲烷污泥颗粒的最外层中是丰富的和几种低分子量脂肪酸（Y.Sekiguchi，Y.KamagatK.Nakamura，A.Ohashi，H.Harada，申请ENVIRON。微生物。 65：1280-1288,1999）。进一步的基于16S核糖体DNA（rDNA）克隆的分析发现微生物被归入独特的分支，绿色非硫细菌（GNSB）细分I，它含有多种来自各种环境样品但不培养的16S rDNA克隆序列代表。为了调查它们在社区和生理特征中的功能，我们试图分离来自原始颗粒污泥的尚未培养的微生物。第一次尝试与隔离区隔离然而，颗粒不成功。在另一个已经处理油炸大豆的嗜热反应器中凝乳制造废水，我们发现丝状微生物长大，导致形成颗粒表面上的投影状结构，使颗粒看起来像海胆。 16SrDNA克隆分析结合荧光原位杂交显示，预测是由与GNSB细分I和Methanothermobacterlike相关的未培养丝状细胞组成细胞和突起的末端仅由丝状细胞组成。通过使用提示的投影作为初级富集的接种物，嗜热的，严格厌氧的，丝状的
细菌，指定菌株UNI - 1，成功分离补充与蔗糖和酵母抽提物。该菌株是一种非常缓慢生长的细菌，其能够仅利用有限的范围碳水化合物在酵母提取物存在下并从这些底物产生氢气。增长是当该菌株与利用氢的产甲烷菌共培养时发现被显着刺激，表明该菌株是糖发酵细菌，生长其中取决于颗粒中的氢气消费者。
上流式厌氧污泥床（UASB）工艺具有在过去的几十年里，它在世界范围内被广泛用于生物制药处理中等和高强度的有机废水（22,31）。虽然嗜热（50至60°C）的UASB过程可应用于高温废水排放来自某些行业的某些制造流程（22，42,51），到目前为止，几乎所有实际的UASB工艺都已经建成已在中温（30至40°C）或环境中操作温度。目前，只有少数实用的UASB在高温下运行的过程。其中一个嗜热者缺乏普及的主要原因
UASB流程是完成时的难度或可靠性较低在嗜热条件下造粒污泥（40,42）。
为了启动UASB流程，成功地形成毫无疑问，种子污泥中稳定的颗粒物是主要的前提。已知影响肉芽化的几个因素，即，污泥中各组分的物理化学性质表面疏水性的细胞（4,11,30），存在胞外聚合物（30,46）和微生物的组成（8,16,30,52,53）。其中，微生物
成分被认为是许多决定性因素案例。
一般而言，是Methanosaeta的丝状和聚集类型除Methanosarcina外通常观察到细胞细胞在嗜温UASB颗粒中（8,12,20,23,24,32,53）。它们被认为对制造污泥的核心很重要通过构建网状结构（53）来形成颗粒。相反，很少观察到长丝型Methanosaeta细胞
在嗜热UASB颗粒中，Methanosaeta细胞的细丝型（分散型）可以频繁地进行被发现（18,19,23,37,39,40,45）。代替Methanosaeta，非常薄的丝状微生物，其中在形态上与Methanosaeta不同，已经有了被认为对形成良好可解决的嗜热性是必不可少的颗粒。这种类型的微生物经常（或者）几乎总是）观察到并发现完全覆盖嗜热菌颗粒，在颗粒上形成网状涂层（32， 于2017年6月8日由嘉宾http://aem.asm.org/下载37，39，40）。但是，没有关于微生物的详细信息可用。
我们以前分析过嗜热菌的群落结构（55°C）的UASB产甲烷颗粒污泥反应器处理人造废水（34）并确定薄壁细胞的系统发育地位和空间分布，通过全周期rRNA方法进行丝状生物体（32）。社区结构中有趣的发现之一分析师认为该部门内部无法识别克隆绿色非硫细菌（GNSB）经常获得来自污泥。随后的荧光原位杂交使用靶向16S rRNA的寡核苷酸探针未培养的GNSB显示反应堆中的GNSB是细丝状细胞并仅在最外层占优势作为重要的嗜热污泥颗粒层之一人口（32）。
为了阐明他们的生理和代谢功能，我们试图培养细丝状微生物
属于GNSB集团的几种厌氧废水污泥。在本文中，我们报告了隔离和部分表征与附属物有关的微生物GNSB组，并提出其在厌氧条件下的生态重要性废水处理过程。
材料和方法
UASB反应堆的运行。 从两个实验室规模收集颗粒UASB反应堆（反应堆I和反应堆II，13升容量），两者都有已经在嗜热（55℃）的温度下操作。 反应堆我吃了一个含有蔗糖，乙酸盐，丙酸盐和酵母提取物的合成底物（4.5：2.25：2.25：1，化学需氧量[COD]比率）（34）。 反应器II已经收到了实际的有机废水从一家油炸豆腐制造厂排出。 两个反应堆表现出良好的COD去除性能，去除效率为90％至95％并在整个实验期间形成良好的甲烷。
微生物，媒体和栽培。使用下列生物体在这个研究中。细丝状菌株UNI-1被富集并分离在这个研究中。 Methanothermobacter thermautotrophicus（以前称Methanobacteriumthermoautotrophicum [49]）菌株H（DSM 1053）Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH（DSMZ，不伦瑞克，德国）。用于富集和分离的培养基如前所述制备菌株UNI-1（17,33）。所有的耕种在55℃下在含有20ml培养基的50ml血清瓶中进行（pH 25℃，7.2）在80％N 2 -20％CO 2（体积/体积）的气氛下无晃动。之前将中和的底物从贮液中加入到小瓶中接种。使用培养基在55℃下培养热自养营养型M.除了将氢气添加到气相（80％N2-20％CO2，体积/体积）作为能量来源。为了共同培养，M.将自养自养H和菌株UNI-1接种到补充的培养基中与蔗糖（20mM）和酵母提取物（0.1％）（5％接种物）混合每个）。
本研究中分离的菌株的纯度通过常规检测显微镜和培养基与含有0.1％酵母提取物和碳水化合物的混合物（蔗糖，葡萄糖，阿拉伯糖和葡萄糖）果糖，每种在2mM）在35或55℃。
原位杂交。如前所述完成颗粒的固定（32）。通过所述的方法进行全细胞原位杂交其他地方（32,34）。用于海上脊柱状投影的原位杂交海胆状颗粒，我们用手术刀小心切开固定突起在双目显微镜下固定玻片上的投影涂有Vectabond（Vector Laboratories）。
在此使用以下16S rRNA-靶向的寡核苷酸探针研究：GNSB633，特异于克隆MUG9和TUG8，-9和-10，分别为如前所述归入GNSB组（32）; EUB338为领域细菌（2）; ARC915为领域古细菌（36）; MX825为属Methanosaeta（27）;和MB1174用于甲烷杆菌科（27）。因为原位杂交，我们通过加入甲酰胺来调节杂交的严格性到杂交缓冲液（对于EUB338，MX825和20％为20％[体积/体积]）
GNSB633,35％用于MB1174和ARC915）。用于双重染色的颗粒切片，吲哚二羰花青（Cy5）和罗丹明标记的探针同时。
构建16S rDNA克隆文库，形成于脊柱状结构颗粒。 DNA提取，PCR扩增，克隆和测序程序用于构建16S核糖体DNA（rDNA）克隆文库如之前报道的那样（34）稍作修改。用于DNA提取从颗粒上的脊柱状结构，我们用磷酸缓冲液冲洗颗粒盐水（PBS; 0.13M NaCl，10mM磷酸钠缓冲液，pH7.2）几次，并用手术刀仔细切割并收集投影在双目显微镜下，通过弱声处理（50W，5至10秒），并进行DNA提取。
为了从突出部分构建16S rDNA克隆文库，我们使用了以下用于PCR扩增细菌16S rRNA基因的引物组：细菌特异性引物EUB341F（5-GGTTACCTTGTTACGACTT-3，位置在大肠杆菌中的341至357）（25）和原核生物特异性引物1490R（5-GGTTACCTTGTTACGACTT-3,1491-1509在大肠杆菌中）（50）。 PCR产物用MicroSpin柱（Amersham Pharmacia Biotech）纯化，随后使用TA克隆试剂盒（Novagen）克隆到质粒中。随机挑选20个克隆rDNA进行测序。
从纯培养物中提取DNA并扩增16S rDNA。脱氧核糖核酸从几种分离物的纯培养物中提取如上所述通过PCR扩增平石（13）和16S rDNA。在这PCR，使用下列引物：细菌特异性引物8F（5-AG在大肠杆菌中的AGTTTGATCCTGGCTCAG-3,8至27）和通用引物1490R（50）。 PCR产物用MicroSpin柱（AmershamPharmacia Biotech）并进行进一步分析。
测序和系统发育分析。代表性的rDNA序列通过Thermo确定纯培养物的克隆以及16S rDNA测序酶荧光标记的引物循环测序试剂盒（Amersham Pharmacia
Biotech）和自动序列分析仪（DSQ-1000L; Shimadzu）等如前所述（17）。序列数据与Clustal X软件包进行比对（38）并通过人工检查进行纠正。构建了系统发生树通过邻居加入方法（28）与MEGA版本2包进行比较（Kumar等人，提交出版）。 Bootstrap重采样分析（10）为了估计树形拓扑的置信度，进行了100次重复。
显微镜和分析方法。细胞在玻璃上固定和杂交幻灯片用荧光显微镜（奥林巴斯BX50F）观看，和检查与探针杂交的切片和脊柱状突出物在共焦激光扫描显微镜下（Olympus Fluoview BX50）。扫描电子显微镜（SEM）如先前所述进行（40）。短链用气相色谱仪（Shimadzu GC-14A;火焰离子化检测器;包装材料，FAL-M（G.L.Science）;柱温度，125℃）。醇和其他化合物通过高压测定液相色谱法（HPLC），使用RSpak KC-811柱（Shodex;洗脱液，3mM HClO4;柱温，50℃）和UV检测器（210纳米;岛津SPD-10A）。碳水化合物，如蔗糖和葡萄糖使用SCR101-H柱（Shimadzu;洗脱液，H 2 O;柱温，60℃）和折射率检测器（Shimadzu RID-10A）。甲烷，氢气和二氧化碳通过气相色谱测定（GL科学模型370;检测器类型，热导率检测;包装材料，Unibeads C;柱温，145℃）。
核苷酸序列登录号。菌株的16S rDNA序列UNI-1以加入方式保存在EMBL / GenBank / DDBJ数据库中没有。 AB046413。
结果
详细分析未培养细胞的系统发育位置从UASB流程中恢复的克隆。在我们以前的研究中，我们恢复了几种类型的未培养克隆GNSB来自中温（35°C）和嗜热（55°C）UASB颗粒污泥（34）。基于rDNA克隆的分析表明这些克隆占约20％
在嗜温性（110克隆）和嗜温性（110克隆）文库中的总克隆嗜热（115克隆）污泥（34）。另外，我们有设计了荧光标记的寡核苷酸探针（GNSB633）特异于那些克隆（MUG9，TUG8，TUG9，和TUG10克隆，称为嗜热UASB簇在图1）来阐明它们的原位形态和空间VOL。 67，2001年培育GNSB细分I细菌5741于2017年6月8日由嘉宾http://aem.asm.org/下载分布在粒状污泥中，导致检测只有嗜热细胞最外层的丝状细胞污泥颗粒（32）。
精确确定这些的系统发育位置GNSB克隆，我们进行了系统发育分析克隆序列与所有已知的16S rDNA / RNAs培养和属于GNSB的非培养生物（图1）。通过这个分析，我们发现我们的GNSB克隆被分类在GNSB细分I（14）内，它包含一个数字的环境16S rDNA序列，但不包含培养的微生物。 由于特定的DNA探针
（GNSB633）与丝状真菌微生物反应我们关注的是嗜热颗粒的最外层这些生物体进一步研究。
图。 1. GNSB的系统发育树，包括环境克隆。 先前研究中获得的16S rDNA序列（MUG和TUG克隆）和参考序列进行比对，并通过邻接法（成对分析）构建系统发生树。 酒吧代表16S rDNA序列中每100个核苷酸的5个核苷酸取代。 Aquifex pyrophilus的序列被用于树根。分支点显示50％以上的Bootstrap值。 每个参考序列的登录号和环境来源克隆也显示在括号内。 栽培生物的名称以粗体和斜体显示。 我们的UASB克隆，被称为嗜热性UASB簇和菌株UNI-1显示在括号中。
在反应器I中。阐明生理和代谢功能探针GNSB633阳性未培养的细丝，我们
试图从这些颗粒中分离出这些微生物反应堆我，这是同样的嗜热反应堆中使用的以前的研究（17,32,34），并已喂食蔗糖，醋酸盐和丙酸盐。由于丝状生物体仅观察到嗜热的最外层产甲烷颗粒（32），这很可能是这些细胞可以利用主要底物如碳水化合物。我们5742 SEKIGUCHI ET AL。 APPL。 ENVIRON。微生物学。 于2017年6月8日由嘉宾http://aem.asm.org/下载因此使用蔗糖，葡萄糖和其他几种
全文共18356字，剩余内容已隐藏，支付完成后下载完整资料
资料编号：[16909]，资料为PDF文档或Word文档，PDF文档可免费转换为Word
以上是毕业论文外文翻译，课题毕业论文、任务书、文献综述、开题报告、程序设计、图纸设计等资料可联系客服协助查找。
