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好氧颗粒反应器中存在的丝状细菌
摘要：在污水处理过程中，丝状菌和微生物生物量沉降问题有关。在好氧颗粒污泥的系统中，丝状菌对颗粒污泥形成初期形成最初的聚集体具有显著作用。然而，它们在成熟的颗粒污泥的系统中的研究较为缺乏。在本论文中，第一次研究了很长时间的操作(300天)的好氧颗粒系统的丝状菌。以人工合成的废水为基质的污泥中，观察到Chloroflexi和Sphaerotilusnatans。这些丝状细菌只能来自接种污泥中。以鱼罐头工业的废水为基质的颗粒污泥中观察到Thiothrix和Chloroflexi。而以加工海产品的工业废水为基质的反应器检测到有Meganema perideroedes。综上所述，以工业废水为基质的成熟颗粒污泥系统中丝状菌的存在形态与工业废水的种类有关。
关键词：好氧污泥颗粒化，工业废水 绿弯菌 浮萍介绍：好氧制粒在微生物自固定化过程中是由不同的选择压力驱动的过程，比如施加的有机负荷率和水力剪切力，反应堆配置，循环时间分布，或者交换率[1]。这是一个渐进的过程，涉及从絮状物进展到粒状总量[2]。好氧颗粒的特点是规则的外形和紧凑的结构[2]，并且主要由微生物种群和胞外聚合物组成[3]。不利的条件像废水成分，底物可用性低，解氧缺乏，固体保留时间长，营养缺乏和高温促进丝状菌生长[4,5]。研究表明，水平较低丝状生长不会导致运行问题甚至可能使颗粒结构稳定[4]。张等人观察到丝状菌出现引发颗粒形成并产生结构支持进一步的颗粒增长。但是，在的情况下丝状过度生长，有氧稳定性颗粒变差。生物质冲刷最终导致好氧颗粒污泥消失[4]。
丝状细菌通常以少量存在于活性污泥中。 在特定条件下它们会扩散到显着的程度从而影响污水处理的性能。他们会膨胀或起泡。 为了控制这些有问题的细菌的增长，他们已经被根据形态类型上的不同分为了三十多种[7,8]
目前，基于形态类型的识别已经常常不足以可靠的鉴定许多丝状细菌，因为一种形态类型可以包含几种同类型的有机体[9]。 例如，以前的研究有揭示了Nostocoida limicola morphotypes是隶属于各种各样的成员Chloroflexi，厚壁菌，放线菌，Alphaproteobacteria和Planctomycetales。 分子技术已经可以解决这些细菌的分类学附属关系[10,11]。 荧光原位杂交（FISH）与r RNA靶向寡核苷酸一直是被用来致力于它们的研究鉴定的方法
不同的研究工作提出了几种策略避免或减轻丝状生物的存在好氧颗粒污泥。 Wan等人[12]研究了这种效应在用合成培养基喂养的好氧颗粒系统中的合适pH。这些作者提出施加碱性条件在反应器内部作为抑制丝 状菌过度生长和维持颗粒稳定性，尽管在这项研究中测试的操作时间仅有14天。 Weissbrodt等人[13]提出了使用密集的上流式曝气和污泥作为接种物的生物营养用来去除系统。这些作者利用了五种不同的好氧颗粒反应器沿着合成培养基喂养40-50天。他们解释说高剪切力的使用有助于打破表面的丝状结构，而来自生物营养物去除过程的污泥表现出较差的的丝状膨化潜力，从现有研究表明，缺乏研究工作在长期操作中研究丝状细菌不适于处理工业废水。
目前的工作重点是研究在好氧颗粒系统中进行丝状生长工业废水和合成介质模拟以前的物理化学方法，在长期实验（120和400天之间）。 基于对长期以工业废水运行的实验室模型的观察，有助于解决全行业运营中可能出现的问题规模化工厂。
材料和方法:
反应器的运行
三个序批式反应器（SBR），R1，R2和R3，运行以获得来自污泥的好氧颗粒污泥接种活性污泥。 SBR运营周期为3小时，短暂沉淀和排出废液期间产生冲洗条件以选择在反应器中造粒[14]。周期分布的选择是旨在获得造粒过程和有机物的去除，对营养素不需要优化去除。每个反应器用不同类型的反应器进料废水，即含絮凝剂絮凝剂（R1）和两种工业废水的合成废水鱼类罐头厂（R2）和海产品加工（R3）植物（表2）。三个SBR的运行地点被安置在圣地亚哥大学实验室孔波斯特拉。每月收集一次工业废水，并在大学设置装置，储存在4°C的环境下，然后再投入SBR。据他说颗粒的形成和获得过程需要稳定的颗粒时间，每个系统的特性都不相同每种饲喂组合物的特征。该有关该操作的详细信息可在Valdel咨询Rio等人。 [15]对于R1，菲格罗亚等人。
用不同的操作方式从反应器中收集数据，对粒状生物质样品进行FISH的分析。。 其中，在这项研究中，相应时期的丝状菌样品被观察和进行分析这些样本对应于丝状细菌的时期观察分析。 样品从R1开始收集第84和115天; 从第268天到第344天从R2开始，R3在192和263天。此外还有对照样品（不含丝状细菌）R2为第99天，R3为第94天。
合成培养基加凝固剂 - 絮凝剂R1
加入含钠的合成溶液乙酸酯作为碳源并补充残余物（2.5mg / L聚合氯化铝）和絮凝剂（1.5mg / L聚电解质）的量通常应用于初期的沉淀废水。 R1在相同条件下平行运行作为控制反应器（RC）的操作条件。 RC是只加入合成培养基而不加入凝结剂 - 絮凝剂试剂并仅用于与R1进行比较。R1和RC接种在的从活性污泥系统收集的浓度为0.5L的活化污泥，用于有机物和氮的去除，且位于城市污水处理厂中（WWTP)。污泥体积指数（SVI）为200 m L / g TSS，固体浓度5 g VSS / L。 已经观察到颗粒R1和RC在操作的第10天。 这些情况在，最极端的是RC小于2毫米，而在R1他们是大于2毫米（见补充数据图1S）。在此期间，SVI从180到40 m L / g TSS降低参数保持在80和100 m L / g TSS之间R1的情况。 聚集体的快速形成。。的SVI可能与其中存在的有关饲料中含有凝结剂和絮凝剂试剂有关，他们促进生物量的聚集，但阻碍了其紧凑性。颗粒表面的丝状菌结构能够被观察到。R1在120天内运行，高COD去除率（图1S）。 从第40天开始进行氮去除主要通过硝化 - 反硝化作用进行。 第84天和第115天，当采集生物质样品时，有机物和氮的去除效率是大约分别为95％和60％。
鱼罐头废水（R2）
R2用鱼罐头生产的流出物喂养工业（西班牙蓬特韦德拉）含有高盐和低盐物质。第1天至第149天使用的饲料包含在内超过9克NaCl/L，在此日期之后的浓度减少到0.1克NaCl/L，由于修改了工业过程。用作接种物的污泥是0.5L絮凝剂活性污泥，来自一个单位的有机物和氮搬迁，位于城市污水处理厂（不同于R1和RC），SVI为100 mL/g TSS。在这个反应堆里，在第45天观察到需氧颗粒的形成。用立体显微镜观察到，在整个操作期间丝状生长在颗粒表面上。（见补充数据图2S）。R2在400天内运行过程中，逐步增加有机物质和氮浓度（图2SA和SB）。有机物质清除效率分别为93％,91％和95％分别在第99天,268天和344天，同时除氮效率分别为25％，31％和26％，主要通过硝化-反硝化作用。在第99天采集的样品与一段高盐条件（9g NaCl/L）和第268天和第344天的样品至低盐水条件（0.1g NaCl/L）相对应。
海洋产品加工废水（R3）
R3用来自工厂加工的废水进料通过海产品（西班牙ACorunagrave;），他的的特点是在有机物方面其组成的变化很大（从380到3800 gCOD/L）和氮气（从370到2,250 mgNH4-N/L）的含量。
从运行的R3生物反应器上取出0.5L活性污泥接种在125m L / g TSS和3.2g的固体浓度VSS /L的海产品上，
大直径聚集体很快开发出来，在启动后的30天内运行。 观察到存在的颗粒达到的高达11毫米值意味着费雷特直径在高速增长。 不同的事件和新的事件发生在整个运营期[17]（见补充数据图3S）
在过程中大部分操作时间都获得高COD的高去除效率，除了这段时间在第98和108天之间; 然而，氮去除效率很低（图3S）。 有机质和氮第94,93和93天的去除效率分别为73％和0％，第192天为93％和12％，第263天分别为93％和14％。
分析方法
用图像分析程序确定[18]用立体显微镜（Stemi 2000-C，蔡司）和
扫描电子显微镜（SEM）（数字SEM 440，徕卡）对颗粒的大小分布和形态经行定期观察。 对于SEM分析，污泥样品被清洗用磷酸盐缓冲液（PBS）固定，并用固定戊二醛3％（v/v）的PBS溶液对其经行定期观察。 固定后，使用乙醇溶液使样品脱水增加乙醇浓度（30,50,70和100％inV/V）
FISH技术应用于分解生物质样品。为了获得颗粒状生物质破碎，将样品超声处理1分钟，65％（135流明）的振幅使用探头超声波仪（UP200s，Hielscher博士）。这些条件仅被选择在不破坏细胞的情况下将颗粒解聚。根据描述的程序进行FISH，阿曼等人的床 [19]。生物质样品最初是用多聚甲醛4％（m/v）固定2小时。然后他们被固定在显微镜载玻片上，随后干燥并且依次浸润在50,80和98％（V / V）的乙醇溶液中。之后与选定探针杂交在46℃下进行1.5小时。列出使用的探针在表1S（补充信息）和细节在探针Base [20]处可用。用于的标准选择的FISH探针是鉴定基于Nielsen等人的丝状细菌。 [9]，根据表1FISH是Meganema perideroedes，Sphaerotilus natans。
表1系统发生关系，物种名称（如果可能的话）和相应的形态类型（改编自Nielsen等[9]）的概述
表2好氧颗粒SBR的操作参数
寡核苷酸探针被用fluorochromes Cy3和FITC经行标记。 原位后用缓冲溶液洗涤杂交载玻片，干燥并用Vectashield H-1200包埋由DAPI（4#39;，6-Di Amidino-2-Phenylindole）染色Atom S.A.（巴塞罗那）。 荧光信号是通过耦合epi-荧光显微镜（Axioskop 2，蔡司）采集系统记录荧光信号。 海浪-探针激发的长度分别为495,558和359nm，而荧光检测分别为519,670和461纳米，三个不同的长度，分别用于FITC，Cy3和DAPI。
结论：
采用两步FISH方法进行检测存在于生物质样品中的丝状群体。Proteobacteri首先应用a类的一般FISH探针
后来，更具体的提供属类水平的阳性信号应用更深洞察这些一般群体。 在补充资料中表明（表1S）了所有探针都经过测试。 没有提供正面信号的探针也列在此表中，但未在此处进一步提及丝状菌被观察和和用探针进行分析的讨论，
R1：合成培养基加凝固剂 - 絮凝剂
从RC收集的生物质样品的化验第114天和第84天和第115天的R1，用探针EUB338裂解混合。 在R1为阳性的情况下结果仅用探针Bet42a获得beta;-变形菌。 在测试了特定探针之后可用于每个丝状生物体（表1S），只有积极的结果在应用探针SNA后获得Sphaerotilus natans（图1a）。 他们的丰富在样品很高并且观察到的特征细丝对应于那些报道的S.natans morphotype（直的或弯曲的护套丝 ），在目前情况下很少超过25 mu;m长。 来自中国的样本比较第84天和115天表明，在两个操作日内丝状菌的丰度相似。
图2在第344天的来自R2的丝状细菌的FISH图像，a图是用于Gammaproteobacteria（Cy3DAPI的探针Gam42a ，b是探针
EUB338
R1中丝状细菌的剩余部分是在应用探针CFX1223后鉴定为绿弯菌门（Chloroflexi）。 Chloroflexi细菌的菌丝
长度在15到25 mu;m之间，并且它们的丰度在此反应堆的重要性如图1b所示natans细菌被发现存在于用于RC和R1的接种物，在第115天的时候在观察到比按照百分比中接种物的低得多R1的（图1a）。 此外，从第114天收集的样品中观察到尽管如此使用相同的接种物，两种丝状菌都没有被观察到，两个反应堆运行的主要区别依靠凝结剂和絮凝剂的存在R1的进料介质。 观察中的发现了这些差异解释了组分对微生物选择的影响 凝固剂是通常带正电，他们的目的是中和排斥电荷（通常是负电荷）tive）周围的粒子。 他们的存在有利于絮凝物的产生，而絮凝剂促进了絮凝物的形成凝聚颗粒凝聚或凝聚成形成较大的絮状物。 两种试剂的加入都可以促进系统中丝状细菌的保留，以及后期的操作条
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