英语原文共 12 页
厌氧/好氧时间对在低盐度情况下同步短程硝化反硝化系统的脱氮和微生物群落的影响
Wuyi Huang1, Zonglian She1,2, Mengchun Gao1,2, Qun Wang1, Chunji Jin1,2, Yangguo Zhao1,2, Liang Guo1,2,
（1. 中国海洋大学海洋环境与生态教育部重点实验室，266100青岛；2. 中国海洋大学环境科学与工程学院，266100青岛）
摘 要：本研究采用复合序批式生物膜反应器(HSBBR)，在合成废水含盐度为1.2％的条件下，研究了同步短程硝化反硝化（SPND）。选择不同的厌氧/好氧（An / Ae）时间来评估污染物的去除性能和反应器中微生物群落的演替。在厌氧/好氧小时比为0 / 6.5时获得最高的有机物去除效率，在稳态下平均化学需氧量（COD）去除率为89.6％。类似地，在厌氧/好氧小时比为1 / 5.5,1.5 / 5和2 / 4.5时实现了高的氮去除效率，平均总氮去除率超过92％。这表明，与厌氧/好氧小时比为0 / 6.5的模式相比，去除率增加了10％以上。高通量测序分析显示，
厌氧/好氧小时比率增加改变了HSBBR中的生物群落结构特征。在悬浮污泥（S-污泥）和生物膜中，厌氧/好氧小时比为0 / 6.5时的优势菌种为偶氮弧菌，而厌氧/好氧小时比率为2 / 4.5和3 / 3.5时的优势菌种是竞争性念珠菌。亚硝化单胞菌是本研究中唯一检测到的氨氧化细菌（AOB）。硝化螺菌属是一种亚硝酸盐氧化细菌（NOB），对盐度和厌氧/好氧模式变化敏感，它仅在完全好氧模式下的悬浮污泥中检测到，占比为0.1％。悬浮污泥和生物膜样品具有相似细菌组成。该研究表明，在复合的悬浮污泥和生物膜反应器中通过共生功能群的同步短程硝化反硝化过程可以实现有效的氮和碳去除。
关键词：厌氧/有氧时间；同步短程硝化反硝化；高通量测序；微生物群落；低盐度
1. 前言
通过同步硝化反硝化（SND）废水脱氮被认为是传统脱氮工艺的高效且有成本效益的替代方法。同步硝化反硝化工艺中，硝化和反硝化在一个反应器的相同操作条件下同时发生。 同步硝化反硝化过程（SND）可以简化操作程序并降低氧气需求和能耗。基于亚硝酸盐的SND或同步部分（或短程）硝化反硝化（SPND或 SSND）需要较少的氧气，并且比基于硝酸盐的同步硝化反硝化消耗更少的能量和碳资源。在SPND系统中，诱导了硝化（氧化成亚硝酸盐）的第一步，但第二步（将亚硝酸盐氧化成硝酸盐）被有效抑制，并且使用亚硝酸盐进行脱氮。 SPND已在序批式反应器（SBR），序批式生物膜反应器中实现。到目前为止，膜生物反应器。已经进行了一些研究以确定通过SPND去除氮的控制参数。这些参数包括温度、溶解氧（DO）水平、盐度和碳源。
盐度是实现SPND的关键因素之一，因为亚硝酸盐氧化细菌（NOB）比氨氧化细菌（AOB）对盐更敏感。据报道，低盐度的9.0 g NaCl L-1可以抑制亚硝酸盐氧化细菌活性，同时增强氨氧化细菌活性。当盐浓度逐渐增加至6.5g NaCl L-1时，能够在序批式生物膜反应器（SBBR）中实现稳定的部分硝化。SPND与盐度关系的研究很少。Wang等人在SBBR中建立了同步硝化、反硝化和有机物去除工艺，以处理盐渍芥菜块废水。结果表明，随着盐度的增加，亚硝酸盐氧化细菌NOB受到显着抑制，短程硝化反硝化（PND）过程逐渐促进了氮的去除。据观察，不同的碳源对微生物群落有很大影响，并导致短程同步硝化反硝化（SPND）工艺处理含盐废水的氮去除机制不同。到目前为止，大多数研究都侧重于在盐水条件下建立SPND过程，而不是使用SPND过程如何影响盐水废水处理的操作条件。没有研究过不同操作模式，特别是厌氧/好氧持续时间对低盐度下SPND过程中氮去除和微生物群落的影响
SND系统中采用的常见操作策略包括完全有氧模式和厌氧 - 好氧（或缺氧 - 好氧）模式。前者通过在反应阶段仅应用曝气来实现，后者通过在曝气阶段之前引入预厌氧（或预厌氧）阶段来实现。在预厌氧阶段，流体中的有机物质可以降解，并且可以减少随后的好氧阶段中的需氧量。此外，在缺氧前阶段通过脱氮产生的碱性条件对随后的有氧硝化作用是有用的。一些研究表明，预氧化模式比完全需氧和有氧/缺氧模式具有更高的脱氮能力。此外，据报道，与完全有氧模式相比，缺氧/好氧模式下的总氮去除率和SND效率分别提高了17.8％和10.1％。在交替的缺氧/好氧SBR中，尽管随着缺氧/好氧时间比的增加氨去除呈下降趋势,但在缺氧/好氧小时比为2/4时实现了最高的总氮去除率。
生物脱氮反应器中的硝化和脱氮效率与微生物群落的多样性和分布密切相关。高通量测序技术已成功用作分子技术，用于评估活性污泥和生物膜中微生物群落的多样性，结构和功能，并确定微生物对环境变化响应的动态数据。张等人（2018）利用Illumina MiSeq测序来分析在厌氧/好氧/缺氧过程中操作的连续流动反应器中的微生物群落。他们发现，在家庭层面上，主要的细菌是红藻科，腐霉科和丛麻科，这些生物共同加强系统中的氮去除。在另一项研究中，应用高通量测序来分析CANON系统中当盐度升高下功能性微生物群落（氨氧化细菌AOB，亚硝酸盐氧化细菌NOB和厌氧氨氧化细菌）的动态变化。然而，高通量测序技术尚未应用于探索SPND工艺中交替的厌氧/好氧栖息地以处理低盐度的废水。间隙通气是以序批式模式操作的反应器的典型特征，其可导致交替的需氧/厌氧条件。交替的有氧/无氧条件对SND或SPND过程是有益的。 SPND工艺已在间歇曝气移动床膜生物反应器中实现，其中还研究了硝化的特征。在另一项研究中，间歇曝气用于在人工湿地中实现同步短程硝化反硝化（SPND）过程。由于间隙曝气的优点，SBR和SBBR已被用作典型的SND或SPND情况。近年来，混合序批式生物膜反应器（HSBBR）引起了人们的兴趣，因为它可以基于反应器中悬浮污泥和生物膜的相互作用通过同步硝化反硝化有效地去除氮。在这项研究中，在低盐度条件下通过SPND工艺开发的HSBBR以不同的厌氧/ 好氧小时比率操作。随着SPND系统无氧期的增加，采用16S rRNA基因高通量测序技术来表征微生物群落的种群和结构的动态演变。该研究的主要目标是：（1）确定SPND过程中氮去除的适当的厌氧/ 好氧小时比，（2）揭示了当低盐度下厌氧持续时间增加时，HSBBR中悬浮污泥和生物膜的微生物群落的变化（3）确定氮去除所需功能性微生物的敏感性，以增加反应器的无氧时间;（4）从微生物生态学的角度探讨SPND系统处理盐水废水的可行性和控制策略。
2. 材料和方法
2.1. 反应器和实验方法
该实验在HSBBR中进行，HSBBR先前已经将盐度从0.0％增加到1.2％，持续155天，以建立稳定的SPND过程。反应器的直径为19厘米，高度为33厘米，工作体积为7.0升（图1）。将两片软组合载体（由聚乙烯醇缩甲醛和聚丙烯箍制成）连接到绳子上并悬挂在反应器中。每个载体的直径为14厘米，特定表面积为1236平方米m-3。 HSBBR每天运行三个8小时。每个循环包含六个阶段：进料（15分钟），厌氧，需氧，沉降（60分钟），倾析（10分钟）和空转（5分钟）。反应时间（包括厌氧和好氧阶段）在一个循环中为6.5小时（390分钟）。在该研究之前进行了确定适当反应时间的实验。先前研究的结果表明，在6.5小时通气期间可以实现铵的完全氧化和高COD去除效率，因此在本研究中将第1阶段的反应时间固定为6.5小时。为了比较在不同的厌氧 / 好氧时间比下操作的HSBBR的性能，循环中
的反应时间在随后的时间段内保持不变，而反应阶段的厌氧持续时间增加。将实验分成具有不同厌氧 / 好氧时间比的七个时期，如表1中所列。使用时间控制装置实现自动操作。在进料阶段期间将3.5L体积的废水进料到反应器中，并且在倾析阶段期间泵出相似体积的流出液，导致水力停留时间（HRT）为16h。在一段时间内达到稳定的性能后，通过增加无氧时间来改变厌氧 / 好氧出稳定的性能。在不同时期，反应器中的微生物需要不同的时间来适应厌氧时间的增加和反应器达到稳定状态，因此七个时期以不同的天数运行。厌氧阶段在没有通气的搅拌条件下进行。在好氧阶段，通过连接到位于反应器底部的多孔扩散器的压缩机（360mL / min）提供空气。厌氧阶段总是在好氧阶段之前。在整个实验过程中，使用置
于HSBBR中的恒温加热器将温度保持在25plusmn;2℃。向反应器中加入合成废水，模拟低盐度的生活污水。合成废水含有约400 mg COD / L和40 mg NH4 -N /L，类似于青岛污水处理厂的影响，在本研究之前进行了调查。废水的组成如下（每升）：0.8g NaAc，0.15g NH 4 Cl，0.05g K2HPO4和12g海水晶体（相当于1.2％盐度）。海水晶体的主要组分是（每10g）：5.3g Cl-，3.3g Na ，0.62gSO42-，0.3gMg2 ，0.1g K 和0.09g Ca2 。合成废水的pH为7.65-7.951.
在本研究初期时，HSBBR中混合液挥发性悬浮固体（MLVSS），MLVSS / MLSS比值和污泥体积指数（SVI）分别为1740 mg / L，0.79和202mL / g。 反应器中的一部分悬浮污泥每周排放一次，来维持反应器中的MLSS浓度保持在约2000mg / L. 该实验的污泥停留时间（SRT）约为96天。
2.2. 分析方法
每两天收集一次HSBBR的流动样品和有效样品，以研究COD，铵态氮（NH4 -N）和总氮（TN）的去除效率。此外，在操作循环期间每15分钟或30分钟从反应器中取出液体样品，以评估COD，NH4 -N，亚硝酸盐氮（NO2-N），硝酸盐氮（NO3-N）的循环分布和在每个An / Ae小时比率下获得稳定性能时的TN。同时记录DO和pH的变化。根据中国水和废水监测分析方法（第四版），对样品中的COD（重铬酸钾法），NH4 -N，NO2 - N和NO3 - N浓度进行了分析。 TN由NH4 -N，NO2-N和NO3-N的总和计算。通过pH探针（PHB-4，中国）和DO检测器（Oxi 330i，WTW，德国）分别测定pH和DO水平。厌氧或好氧阶段的SND效率由方程式计算。 （1）。该公式通常用于计算SND效率。
ESND=【1-（NO-x,e-NO-x,i）/(NH 4,i-NH 4,e)】times;100%
ESND即是指SND过程效率; NOx,e-（N mg / L）是厌氧或好氧阶段结束时亚硝酸盐和硝酸盐中的氮; NOx,i-（N mg / L）是厌氧或好氧阶段开始时亚硝酸盐和硝酸盐中的氮; NH4,i （N mg / L）在厌氧或好氧阶段开始时为铵态氮; NH4,e （N mg / L）是厌氧或好氧阶段结束时的铵态氮。在上式中，没有考虑微生物生长的氮损失，因为在反应阶段通过微生物吸收除去少量氮。根据Ge等报道的方法（2010），本研究计算了通过生物量同化过程去除的氮量。结果表明，同化的氮量仅约占在循环中除去的总氮的0.56-0.62％。因此，在一个HSBBR循环期间假定微生物生长的氮损失可忽略不计，类似于先前研究中的情况。
2.3. 微生物群落分析
为了揭示实验期间的微生物群落及其演替，在第1,5和7期结束时对应的厌氧/好氧小时比分别为0 / 6.5,2 / 4.5,3 / 3.5,在此时同时从反应堆收集悬浮污泥和生物膜样品。根据氮转化和操作模式，选择第1,5和7期作为三个代表性的过程，这些过程具有较差的反硝化作用，也有良好的硝化反硝化作用，和较差的硝化作用。在第1阶段（即本实验的初始阶段），由于反应阶段的完全好氧阶段而发生差的反硝化作用，导致TN去除效率低（80.15％）。随着厌氧时间的增加，促进了脱氮能力和TN的去除。在第5阶段期间，由于适当的厌氧/好氧持续时间比例，实现了有效的硝化和反硝化，导致高TN去除效率（92.3％）。尽管在第4阶段比在第5阶段实现了略高的TN去除效率（93.0％），但在第4阶段中更长的有氧持续时间（5.0 h）可能导致更多的氧气消耗。基于这些比较，假设时期5是具有高TN去除率和低能量消耗的代表性实验阶段。在第7期（即期间实验的最后阶段），较低的NH4 -N硝化能力导致TN去除效率降低（85.4％），这反映了较长的厌氧持续时间对氮去除的影响。
当反应器中的液体充分混合时，从安装在液体高度中间的出口收集悬浮污泥。生物膜样品是从生物膜的外层到内层收集到的混合物。根据制造商的说明，使用强力土壤DNA提取设备即PowerSoil DNA Isolation Kit（直接从悬浮污泥和生物膜样品中提取基因组DNA。用引物组515F（5#39;-GTGCCAGCAGCCGCGG TAA-3#39;）和907R（5#39;-CCGTCAATTCCTTTGAGTTT-3#39;）来实施聚合链式反应（PCR）的强化扩增，扩增16S rDNA的V4-V5区域。制备总体积为30mu;L的反应混合物，其中含有15mu;LPhusion MasterMix（2x），3mu;L底泥（2mu;M），10mu;L每g DNA（1ng /mu;L）和2mu;LH2 O. PCR方案如下：98℃1分钟，然后30个循环（在98℃变性10秒，在50℃退火30秒，在72℃延伸30秒）和最终延伸步骤在72°C下保持5分钟。根据Zhe
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