预测拥挤分子对离子—RNA相互作用的影响
Tao Yu,Yuhong Zhu, Zhaojian He,and ShiJie Chen
摘要：我们开发一个新的统计力学模型来预测离子minus;RNA分子在拥挤环境下的相互作用。通过考虑离散分布的拥挤分子，这个模型可以探讨主要的拥挤分子造成的影响，如与离子竞争的RNA分子绑定的机会，拥挤分子的存在引起的介质环境的变化而导致的静电相互作用的变化以及非极性水化状态下的拥挤分子minus;RNA系统的变化。为了提高计算效率，我们使用随机方法对拥挤分子的分布进行了采样: 在RNA表面附近的拥挤分子中，我们对它们的离散分布进行采样; 对于从RNA表面分离出来的大部分溶剂，我们使用一个连续的平均场分布。此外，我们利用紧密结合的离子模型(TBI模型)来解释离子波动和关联效应在离子minus;RNA相互作用计算中的影响。该模型应用于各种简单的RNA结构，如RNA螺旋结构，显示了一个拥挤分子诱导的自由能增加和离子结合减少。这种拥挤分子效应往往会导致RNA结构的不稳定。进一步的分析表明,这些影响与拥挤分子minus;离子竞争RNA绑定和有效介电常数下降有关。这个简单的离子效应模型可以作为一个有用的框架，用于建模更真实的拥挤分子和更大、更复杂的RNA结构。
介绍：体内细胞环境非常拥挤1,2。拥挤分子的体积分数可以占到30%3,4，它可以影响细胞的化学活性、物理结构和生物分子的体内功能，包括RNA2,4,5。例如，拥挤分子可以增加蛋白质的寡聚和聚集2，减少小分子和大分子的扩散，并大大限制大颗粒和细胞器的流动性6,7。先前的研究表明，拥挤的分子可以明显影响RNA结构、折叠稳定和动力学特性。8—17 其中一个重要的拥挤效应在离子minus;RNA相互作用中。拥挤分子可能通过三个主要作用影响RNA和离子介导的RNA稳定性的离子分布:（a）拥挤分子体积排斥导致与离子—RNA相互作用的竞争，2 （b）拥挤分子导致有效介电环境的变化，8（c）由于拥挤分子—RNA的相互作用导致RNA水合能变化。2
因为RNA在其主链上携带大量的负电荷，所以离子结合对于稳定RNA结构至关重要。18,19 大多数束缚离子在主要和次要的凹槽中聚集(距离在8Aring;以内的螺旋轴)和表面区域(离轴10minus;15Aring; )。20—23拥挤分子的存在会占据RNA表面周围的空间，从RNA结合中排除离子28，导致束缚离子的数量的减少。此外,拥挤分子可能有比水更低的有效介电常数,因此可以提高磷酸－磷酸排斥和阳离子minus;RNA吸引,导致总静电自由能的变化。上述的拥挤分子导致的变化依赖于整体的拥挤分子体积分数以及拥挤分子的离散的空间分布。
除了对静电相互作用的影响外，拥挤分子还可以通过非静电效应影响RNA的折叠。2,10例如，被排除拥挤分子的体积可以对RNA的构象空间施加一个显著的限制，特别是对展开状态。这样的非静电效应和静电效应,会导致从离子—RNA系统的平衡转变为新的离子—拥挤分子—RNA系统。
最近，拥挤效应在理论和实验研究方面得到了更多的重视。1,2关于RNA折叠的拥挤效应，有两个关于拥挤效应的主要结论。首先，人们发现，拥挤分子能够稳定RNA的折叠态。例如，中性共溶质被发现可以稳定锤头状核酶的三级结构，这是由增强的核酶活性所导致的。25与实验结果一致的是，粗糙的计算机模拟显示，与发夹相比，拥挤分子可以增强假结稳定性。26从物理上来说，这是因为从拥挤分子中排除的体积可以减少RNA的构象熵，而且对于扩展的构象来说，其效果比紧凑的构象更明显，这就导致了致密状态的稳定。27其次，研究发现，由于在展开状态下的优先基聚类（osm电解质）相互作用，使冠状结构具有溶解性，从而导致RNA二次结构的不稳定。28与此相反，对于三级结构，良好的碱性离子（在水分子间）接触和不适宜的脊液（超过水的溶合物）的接触会导致更复杂结构和离子依赖的聚集效应对RNA的折叠稳定性产生影响。28这些结果表明了为各种协同或竞争效果建立定量模型的必要性。
在实验研究的基础上，29—37对拥挤分子影响下的离子RNA相互作用进行了理论研究。2,8,38例如,不考虑离散拥挤分子分布和拥挤分子排斥体积，泊松minus;玻尔兹曼模型与一个有效的拥挤分子体积研究了拥挤环境对蛋白质溶解度的影响。8分子动力学模拟具有明显的优势，可以清楚地解释拥挤分子与大分子(蛋白质和RNA)之间的原子相互作用;38然而，这种方法在拥挤系统上的应用受到了拥挤和离子分布的巨大采样空间的限制。我们需要一种新的方法来采样离散空间分布的拥挤分子和离子。摘要本文提出了一种新的模型，用于预测离子RNA静电作用的拥挤效应。为了有效地对拥挤分子的分布进行采样，我们根据拥挤效应的强度将RNA周围的空间划分开来。当拥挤分子的区域接近RNA的表面，我们认为拥挤分子的离散分布，其排斥体积和介质效应可能明显影响离子minus;RNA相互作用。对于远离RNA表面的拥挤分子，我们使用了拥挤分子体积分数依赖介电常数来解释拥挤分子的静电效应。这样一个模型允许我们把离子minus;拥挤分子竞争与RNA的结合。此外，我们还可以从溶剂可达表面积(SASA)的变化来估计RNA的非极性水化能。
关于离子—拥挤分子—RNA的拥挤模型
我们首先取样拥挤分子分布;然后，对于每一个拥挤分子分布，我们取样离子分布，从中我们计算静电自由能和预测离子结合。最后,统计平均值是在离子—拥挤分子—RNA系统中在所有可能的拥挤分子分布导致的拥挤效应上算出的。
抽样拥挤分子分布：我们使用碱基对(bp) RNA螺旋来说明这种方法。在实验研究中，聚乙二醇（PEG）是广泛应用模拟生物分子系统中的聚集剂。29,39,40PEG聚合物是相当灵活的，它的构象状态可以以自我避免的随机漫步为模型PEG600的“平均结构”可被视为球形，其回转半径为7.0 Aring;。39,40PEG的低电子密度(与水相比较)使其对数据的收集和分析非常有用。此外，PEG可以被视为一种惰性聚合物，它与RNA的表面相互作用较弱。这一特性使我们可以忽略拥挤分子和RNA之间的特定化学反应。29,39,40在实验研究之后，我们用PEG600作为聚集剂。为了进一步简化系统,我们模拟拥挤分子球体(参见图1)的介电常数f1εc为20.0和7.0Aring;的半价(PEG600的回转半径)。24,29,40
图1所示。在内部采样盒(ISB)中，围绕一个RNA螺旋和一个离散的拥挤分子分布的快照，对拥挤分子(黄色球体)的示意图。
在离散拥挤分子分布的采样中，为了最小化边界效应，我们在RNA周围设置了一个大的采样框(见图1)。在12个bp的RNA螺旋体周围有一个140 Aring; times; 140 Aring; times; 140 Aring;的盒子，大约有200个拥挤的球体，体积分数等于20%。我们随机地将200个球体放在不同的网格点上使用(均匀的)蒙特卡罗抽样。我们将拥挤分子建模为硬球体，并且不允许在拥挤分子、离子和RNA之间重叠(由于排斥的体积效应)。采样过程会导致大量的拥挤分子分布。由于需要非常长的计算时间，所以对拥挤分子分布的完整采样是不可能的。为了避免这个问题，我们提出了一个混合模型，它解释了在“重要”区域(靠近RNA表面)和其他区域(远离RNA)的平均分布的离散的拥挤分子分布。因为束缚离子分布在RNA的周围,拥挤分子在RNA表面(重要地区)可以强烈影响离子minus;RNA相互作用。在数学上，我们用一个内部采样盒(ISB)在RNA周围标出了这些重要区域(见图1)。ISB的边界被定义为从RNA表面测量到溶液的正常距离(ISB宽度或盒子宽度)。由于冠状体的直径被假定为14Aring;，无论RNA结构如何，最小的ISB宽度总是大于14Aring;。我们的测试结果表明，模型所预测的结果将比弱依赖于RNA结构的参数(参见下面的“最佳ISB宽度的估计”部分)更大。在ISB中，我们采样离散的拥挤分子分布。大分子的存在影响了溶液的介电常数。这一范围内，溶液的介电常数为：
其中，为大分子的体积分数，为有大分子时溶液的介电常数，为无大分子时溶液的介电常数。
离子minus;RNA静电相互作用模型(对于一个给定的拥挤分子分布)
Crowder模型是对于一个给定的拥挤分子分布，预测离子minus;RNA静电相互作用的模型。离子，特别是在RNA周围的多价离子，局部浓度可能会较高(ca.数摩尔浓度)，因此可能与静电相互有很强的相关性。为了说明离子的相关性和波动效应，我们使用了之前提出的TBI模型。TBI模型的基本思想是通过列举离散的多体离子分布来考虑相关的离子分布。数学上，这是通过区分两个不同的区域来实现的: 紧密结合的(TB)和扩散结合(DB)区域，分别对应于强和弱库仑相互关系的离子区域。根据离子浓度，紧密结合的(TB)区域通常是围绕RNA的薄层，而扩散结合(DB)区域覆盖其余部分(在远离RNA表面的溶液中)。单价离子(如K 和Na )的相关效应可以忽略不计，除非离子浓度非常高(例如，数摩尔浓度)。与此相反，在RNA表面周围的多价离子(如Mg2 )的相关性甚至可以很强烈，即使是在亚毫摩尔浓度。扩散离子通过泊松（PB）方程确定连续分布，而束缚离子则用离散的离子分布进行处理。为了抽样束缚离子的分布，束缚离子被放置到不同的“细胞”中，每个细胞是一个磷酸盐周围的区域。束缚离子分布的集合是通过将束缚离子分配给不同细胞的不同方法产生的。我们把每一个这样的离子分布称为离子结合模式。拥挤分子的存在会阻碍离子的自由分布。此外，作为电介质球的拥挤分子，可以影响ISB中的介电环境。因此,束缚离子的边界地区,有效离子绑定分数,和每个绑定离子的静电能量都依赖于给定的拥挤分子分布C和离子绑定模式M。拥挤分子周围电荷的静电能可以计为自身能量、偏振能量和电荷的库仑能之和:
假设，该体系给定大分子的分布以及离子分布情况，则静电自由能为：
(sim;20)和(sim;78)是RNAminus;拥挤分子系统和水的介电常数，其中为自由能，为极化能，为静电能。是磷酸的电荷数，是离子的电荷数，是孤立离子到RNA的距离，是离子半径，是RNA主链，即磷酸的固定距离。是m和n之间的距离。
对于给定的束缚离子模式M的静电自由能等于束缚离子的上述自由能的总和和扩散离子和束缚离子的相互作用的自由能（由PB算得）。对于一个给定的克劳德分布C，统计平均值是在所有不同模式M上给出了平均静电自由能。因此给定大分子分布的体系静电自由能为：
对于给定的拥挤分子分布C的非极性溶剂的溶解能量，从溶剂可及的表面区域（C）的变化计算：
表面张力系数lambda;等于0.0054kcal/ (mol·Aring;2)和等于0.92 kcal/mol 。
对于一个给定的拥挤分子分布C，溶剂可及表面面积的变化被定义为
是拥挤分子—RNA溶剂可及表面区域，和分别是RNA和拥挤分子的溶剂可及表面区域。
集合平均除以拥挤分子分布C给出总平均自由能。系统的总能量为：
估计最优ISB宽度
模型中一个重要的问题是ISB宽度的选择。理想情况下，为了提高采样效率，需要一个较小的ISB。然而，为了确保模型的稳健性和准确性，理想地，ISB应该足够大，使得理论预测将不会对ISB宽度的选择太敏感。物理上，这样的鲁棒性表明，在边界上离散的拥挤分子分布的影响可以平滑地匹配均匀连续分布的影响。为了找到ISB宽度的最优选择，我们测试了静电自由能对ISB宽度的敏感性(见图2)。12个碱基的RNA螺旋在25°C的0.1摩尔氯化钠、0.01摩尔MgCl2以及20%拥挤分子体积分数的溶液里,我们发现框宽度小于20 Aring;,自由能框宽度十分敏感,表示强烈依赖的介电和排斥体积影响离散拥挤分子在ISB边界的分布。
图2 在ISB内部的拥挤分子数量和由不同的框宽度计算的自由能变化。(a)为不同的箱宽在ISB中聚集的球体数目。结果是计算一个12个碱基的RNA螺旋在溶液中包含拥挤分子、(固定)体积分数(fc = 0.2)和离子为0.1摩尔NaCl和0.01摩尔MgCl2。(b)预测系统水化能量Delta;Gsurface(灰色),静电能量Delta;Gele(红色),和总能量Delta;Gtot(蓝色)。
随着盒子尺寸的增加，ISB边界上的拥挤球体与RNA的距离相对较远;因此,拥挤影响离子minus;RNA相互作用,这主要发生在RNA表面,对离散拥挤分子分布不敏感。事实上，我们发现自由能收敛于大的采样盒的稳定结果。在测试系统中，球体的直径为14Aring;。因此，为了尽量减少采样盒的边界效应，我们在RNA表面允许有足够的ISB空间和采样盒边界之间至少容纳两个拥挤分子球体。此估计设置可接受的最小盒宽度为28Aring;。在我们的计算中，我们选择箱宽30Aring;。对于大于30Aring;的盒子宽度，总自由能和自由能与盒子宽度的变化保持稳定(见图3)。
图3 预测12个碱基的RNA螺旋结构的总自由能Delta;Gtot，ISB宽的函数在含有拥挤分子（蓝色，体积分数fc = 20%）和没有拥挤分子(灰色，体积分数fc = 0
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